桑軍軍等

摘 要 我國深部真菌感染的發(fā)病率明顯上升，實(shí)驗(yàn)室檢查是診斷真菌感染的重要依據(jù)，而目前實(shí)驗(yàn)室診斷水平遠(yuǎn)不能滿足臨床實(shí)際需求。本文對目前現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)行了回顧，指出了目前我國深部真菌感染的早期診斷的難點(diǎn)及發(fā)展趨勢，并立足現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)及臨床檢查手段提出了深部真菌感染的早期診斷策略。

關(guān)鍵詞 深部真菌感染 早期診斷 血清學(xué)診斷 分子生物學(xué)診斷

中圖分類號：R519； R446 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C 文章編號：1006-1533（2014）09-0004-04

ABSTRACT The incidence of invasive fungal disease has significantly increased over the past two decades in China. Laboratory test is an important basis for the diagnosis of fungal disease， but the current level of the laboratory diagnosis can not meet the demand for clinical practice. This article reviews the currently available laboratory diagnostic techniques， and points out the difficulties and the development trend of the laboratory test. At the same time， we propose some strategies for early diagnosis of invasive fungal infections based on existing technologies and clinical examination methods.

KEY WORDS invasive fungal disease； early diagnosis； serological diagnosis； molecular diagnosis； strategy

1 深部真菌感染現(xiàn)狀

深部真菌感染指真菌侵入內(nèi)臟、血液、黏膜或表皮角質(zhì)層以下深部皮膚結(jié)構(gòu)引起的感染，包括局限性的單一器官感染（如肺念珠菌?。┖?個(gè)及以上器官或組織受侵犯的系統(tǒng)性真菌感染（如播散性念珠菌病）。由于深部真菌感染危害性大、病死率高，國外學(xué)者將這類疾病統(tǒng)稱為侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD），并制定了詳細(xì)的確診、擬診和疑似3個(gè)診斷級別和相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。雖然對此命名法還有爭議[2]，但是由于其診斷標(biāo)準(zhǔn)詳盡，層次分明，國內(nèi)臨床多個(gè)學(xué)科制定的一系列診斷和治療原則都是以IFD為基礎(chǔ)制定的。

由于大劑量廣譜抗生素、抗腫瘤藥物的長期應(yīng)用、各種導(dǎo)管在體內(nèi)的介入以及惡性腫瘤、艾滋病等免疫功能低下患者的不斷增加，深部真菌感染的發(fā)病率明顯上升，日益成為患者死亡的重要原因之一[3-4]。近30年來深部真菌感染呈持續(xù)增多趨勢，美國49所醫(yī)院連續(xù)7年的監(jiān)測資料表明，念珠菌敗血癥在醫(yī)院感染敗血癥中居第4位，僅次于凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和腸球菌，病死率則居首位[5]。中國近年來，條件致病性真菌感染亦呈顯著上升趨勢，其中念珠菌感染居首位，侵襲性曲霉病已成為器官移植患者常見的合并癥，隱球菌性腦膜炎在中國人群中也很常見[6]。根據(jù)我國醫(yī)院感染監(jiān)控網(wǎng)分析顯示，醫(yī)院真菌感染率不斷上升：1993-1996年為13.9%，1999-2000年的24.4%，2004-2010年為27.6%。從流行病學(xué)看，深部真菌感染可發(fā)生在2～95歲的任何年齡區(qū)段，其中65歲以上老年患者占83.1%[7]。尸檢研究發(fā)現(xiàn)，75%的IFD病例在生前漏診，而漏診率高的主要原因是目前的IFD，尤其是煙曲霉等絲狀真菌感染所致的IFD的實(shí)驗(yàn)室診斷水平遠(yuǎn)不能滿足臨床需求[8]。絕大多數(shù)深部真菌病起病隱匿、預(yù)后兇險(xiǎn)，患者無特異的臨床表現(xiàn)，很難與其他侵襲性疾病區(qū)分。

2 深部真菌實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)現(xiàn)狀

目前侵襲性真菌感染的診斷分為三個(gè)層次：確診、擬診和疑似。主要從宿主因素，臨床標(biāo)準(zhǔn)和微生物學(xué)證據(jù)三個(gè)方面進(jìn)行綜合評估。宿主的危險(xiǎn)因素主要包括器官移植，免疫抑制劑使用，先天性免疫缺陷等；臨床標(biāo)準(zhǔn)主要是影像學(xué)、支氣管鏡等輔助檢查的特征表現(xiàn)；真菌學(xué)證據(jù)主要包括直接或間接檢測到真菌感染存在。其中微生物學(xué)證據(jù)是診斷的關(guān)鍵。如正常無菌組織鏡檢、病理或培養(yǎng)陽性即可確診。對于酵母菌感染血清學(xué)證據(jù)也可確診，如腦脊液隱球菌乳膠凝集實(shí)驗(yàn)陽性即可診斷隱球菌感染，但是血清學(xué)證據(jù)陽性對霉菌感染不能確診，只能診斷為擬診病例。實(shí)驗(yàn)室檢查是尋找微生物學(xué)證據(jù)的手段。目前，深部真菌實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括鏡檢、培養(yǎng)、血清學(xué)診斷、組織病理學(xué)檢查和分子生物學(xué)方法[3]。

2.1 直接鏡檢和培養(yǎng)法

鏡檢包括直接鏡檢和染色鏡檢，是最簡單、直接和實(shí)用的真菌實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)方法。直接鏡檢是真菌學(xué)檢查學(xué)最經(jīng)典方法，對于一些特征明顯的深部真菌能快速做出初步診斷。如在腦脊液中發(fā)現(xiàn)帶有莢膜的酵母細(xì)胞時(shí)，考慮隱球菌感染；在吞噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞時(shí)可考慮組織胞漿菌或馬爾尼菲青霉感染；在深部組織中發(fā)現(xiàn)有分隔的成45度分支的菌絲時(shí)可考慮曲霉感染；另外在腦脊液等無菌體液中發(fā)現(xiàn)真菌?？擅鞔_診斷，但在采自口腔、陰道等有菌部位的臨床標(biāo)本只有鏡檢發(fā)現(xiàn)大量菌絲才有診斷意義。培養(yǎng)法可以直接觀察真菌生長，明確真菌菌種分類，并同時(shí)做藥敏實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)臨床用藥，適用于痰、血液、腦脊液、胸腹水等深部組織標(biāo)本的真菌培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間一般為2～4周，個(gè)別生長緩慢的真菌如組織胞漿菌則需要更久；根據(jù)不同的真菌選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基；有時(shí)溫度也可作為鑒定真菌種屬的手段之一，如雙相真菌在不同的溫度形成的菌落形態(tài)不同，黃曲霉可45 ℃生長等。目前，酵母樣致病真菌的鑒定體系比較成熟規(guī)范，主要從形態(tài)學(xué)特征和生理學(xué)特征2個(gè)方面來鑒定，國內(nèi)外臨床真菌實(shí)驗(yàn)室已普遍采用商品化的試劑盒及顯色培養(yǎng)基來鑒定酵母菌，可以較好地滿足臨床需求。

2.2 組織病理學(xué)檢查

組織病理對于深部真菌感染的診斷具有重要意義。在組織切片中發(fā)現(xiàn)真菌菌絲和孢子，是對深部真菌感染診斷有力的證據(jù)，其結(jié)果可能比直接鏡檢和培養(yǎng)的診斷意義更大。根據(jù)病原真菌在組織內(nèi)的表現(xiàn)，可將病原真菌鑒定到屬的水平，如許多病原真菌在組織內(nèi)表現(xiàn)為菌絲，根據(jù)菌絲的形態(tài)，可以將其鑒定至屬的水平，發(fā)現(xiàn)無色分隔、分枝的菌絲多為霉菌，如曲霉；發(fā)現(xiàn)粗大、不分隔、少分枝或直角分枝的菌絲多為接合菌。

2.3 血清學(xué)診斷

血清學(xué)檢查是目前深部真菌感染診斷的重要手段。用于診斷真菌感染的血清學(xué)技術(shù)包括檢測抗體、抗原和代謝產(chǎn)物，其中以檢測抗原最為常用。該方法能快速得出結(jié)果，為臨床醫(yī)生提供快速的診斷依據(jù)。目前臨床應(yīng)用較多的是半乳甘露聚糖（GM試驗(yàn)）、（1， 3）-β-D-葡聚糖（G試驗(yàn)）、隱球菌莢膜多糖抗原等。

2.4 分子生物學(xué)方法檢測

分子生物學(xué)檢測手段是國內(nèi)外真菌感染診斷研究的熱點(diǎn)。多種分子生物學(xué)技術(shù)，如DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）分析、DNA擴(kuò)增性片段長度多態(tài)性（AFLP）分析、核糖體RNA基因序列分析、巢式PCR等都先后應(yīng)用于IFD的真菌分子鑒定及分子流行病學(xué)研究，具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)[9]。

3 深部真菌病實(shí)驗(yàn)室診斷的難點(diǎn)及展望

目前深部真菌病實(shí)驗(yàn)室檢查主要有以下幾個(gè)難點(diǎn)。

3.1 傳統(tǒng)的真菌常規(guī)檢查技術(shù)不能滿足早期診斷的迫切需求

真菌感染的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷方法主要依靠形態(tài)學(xué)方法來尋找病原體，包括組織病理學(xué)檢查、顯微鏡涂片檢查和真菌培養(yǎng)檢查等。在組織中證實(shí)存在真菌才是深部真菌感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。有關(guān)侵襲性真菌感染的診療指南中均強(qiáng)調(diào)：確定侵襲性條件真菌感染一定要具備真菌向組織內(nèi)侵入、增殖的直接證據(jù)，否則不能確診。這些常規(guī)技術(shù)常常受檢驗(yàn)人員的技術(shù)熟練程度和標(biāo)本的采集方法、部位和采集時(shí)機(jī)等諸多主觀因素的影響，有時(shí)不能夠得到客觀的陽性結(jié)果。而真菌培養(yǎng)所需時(shí)間長，報(bào)告結(jié)果的時(shí)間長達(dá)數(shù)周，也給臨床醫(yī)生的工作帶來極大不便，常常延誤了患者的最佳治療時(shí)機(jī)。另外一些全身性感染者很難承受侵入性的取材方法（如支氣管肺泡灌洗液、肺組織活檢、腦脊液）等，也給真菌檢查帶來一定難度。

3.2 血清學(xué)方法早期診斷深部真菌感染仍需完善

血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)等非培養(yǎng)法雖有了較大的進(jìn)展，但敏感性和特異性仍難以滿足臨床診斷的需要。被檢測的理想真菌抗原應(yīng)具備以下幾方面：①侵襲性真菌感染早期即顯著升高，且病情發(fā)展中持續(xù)存在；②檢測陽性時(shí)能提示感染，而不受真菌定植的影響；③真菌抗原高度保守，與人體或其他微生物成分無交叉反應(yīng)；④抗真菌治療前抗原顯著升高，治療有效后能逐漸或顯著降低，以幫助監(jiān)測療效；⑤所構(gòu)建的方法穩(wěn)定、實(shí)用、易于推廣。GM抗原、BG抗原檢測在絲狀真菌中應(yīng)用較多，但尚無一種完全符合上述條件的抗原用于深部真菌病的診斷，特別是難以區(qū)別是致病真菌還是定植的真菌。曲霉GM檢測是目前國際上公認(rèn)的一項(xiàng)侵襲性曲霉病的診斷方法，其缺點(diǎn)是某些食物或藥物影響可導(dǎo)致假陽性結(jié)果[10]。檢測真菌細(xì)胞壁成分的G試驗(yàn)，對全身性真菌病的診斷進(jìn)行篩查，特異性強(qiáng)，缺陷在于易出現(xiàn)假陽性，而且無法區(qū)分真菌種類[11]。

3.3 分子生物學(xué)技術(shù)用于深部真菌早期診斷是一個(gè)大趨勢

近年來，以PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展似乎為快速、敏感、特異的深部真菌病診斷開辟了一條新途徑[12-13]。目前，國內(nèi)外已將RAPD、AFLP、RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）等基于普通PCR的真菌DNA指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于對侵襲性酵母菌病、隱球菌病和曲霉菌病的病原體分子檢驗(yàn)，在科研階段也取得了相對滿意的結(jié)果[14-15]。但在以下幾個(gè)方面需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善：①對臨床標(biāo)本敏感性不高，限制了其在臨床真菌感染檢驗(yàn)中的推廣應(yīng)用；②操作程序復(fù)雜、需要設(shè)備多且臨床體液標(biāo)本中的致病真菌DNA含量往往不能滿足PCR檢測需要，目前尚無比較成熟的商品化系統(tǒng)能夠全面完成該檢測工作；③目前對篩選出的特異引物，還有待經(jīng)過大量不同種屬菌株來證實(shí)這些引物的特異性[16]。隨著可應(yīng)用測序技術(shù)的提高、更寬和更可信賴數(shù)據(jù)庫的建立，分子生物學(xué)技術(shù)將會為深部真菌感染的診斷帶來革命性的發(fā)展。

3.4 區(qū)分定值和致病態(tài)的真菌是診斷的難點(diǎn)

如何早期、特異地區(qū)分高危人群人體組織中處于定植及致病態(tài)的真菌是深部真菌病早期特異性診斷的真正難點(diǎn)?；诿庖邔W(xué)基本原理的真菌血清學(xué)檢測技術(shù)對于解決該難點(diǎn)顯然還有很大的發(fā)展空間。例如，利用目前先進(jìn)的蛋白質(zhì)組學(xué)等組學(xué)技術(shù)分析真菌在人體中定植態(tài)與致病態(tài)表達(dá)蛋白產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物的差異，發(fā)現(xiàn)真菌由定植態(tài)向侵襲態(tài)轉(zhuǎn)變的規(guī)律性的、新的分子標(biāo)志物對于解決深部真菌感染早期特異性診斷水平意義重大。

4 深部真菌感染早期診斷的策略

現(xiàn)階段侵襲性真菌感染的早期診治有賴于更多的流行病學(xué)信息、臨床醫(yī)師診療水平不斷提高、診斷標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確制定、檢查技術(shù)的合理運(yùn)用、臨床資料的綜合判定以及實(shí)際經(jīng)驗(yàn)的不斷總結(jié)。

4.1 開展流行病學(xué)調(diào)查

對病原真菌環(huán)境分布和臨床分布進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和比較，了解臨床菌株與環(huán)境株的關(guān)系，環(huán)境株的地域分布、毒力和侵襲力等信息，為易感人群的防控打下基礎(chǔ)。一些深部真菌感染，如組織胞漿菌、馬爾尼菲青霉都被證實(shí)有一定的地域分布特征[17-18]，研究深部真菌病原菌的流行病學(xué)，對深部真菌病的防控具有一定的指導(dǎo)意義。

4.2 加強(qiáng)臨床醫(yī)師的規(guī)范培訓(xùn)

深部真菌感染患者病死率隨經(jīng)驗(yàn)治療開始時(shí)間的滯后而增高，及早給予經(jīng)驗(yàn)治療能挽救更多患者的生命[19]，說明臨床醫(yī)師在真菌感染的早期診斷、早期治療方面起著重要作用。為提高臨床醫(yī)師的素養(yǎng)，做好與實(shí)驗(yàn)檢測人員的配合，達(dá)到早期診斷的目的，我們應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)知識的培訓(xùn)：通過流行病學(xué)知識，了解侵襲性真菌感染的多發(fā)性及發(fā)病特點(diǎn)，提高對侵襲性真菌感染發(fā)病認(rèn)識；全面了解真菌檢測技術(shù)運(yùn)用、發(fā)展情況及各類檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)，能針對性地配合實(shí)驗(yàn)室人員選擇有效的檢測和手段；注重臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)經(jīng)驗(yàn)與傳承，不斷豐富相關(guān)知識，提高診療水平。

4.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)的制定

隨著真菌病院內(nèi)外流行和爆發(fā)事件的增加，需要進(jìn)一步加強(qiáng)對真菌感染的預(yù)防和認(rèn)識，尤其是大規(guī)模的侵襲性真菌病爆發(fā)事件，對臨床醫(yī)療和公共衛(wèi)生都具有挑戰(zhàn)意義。借助臨床知識、分子生物學(xué)分型和檢測方法等手段明確真菌病的診斷、查明致病因素和傳播途徑，對侵襲性真菌感染的及時(shí)治療、疾病發(fā)展和蔓延的控制都具有重要意義。針對侵襲性真菌感染的多發(fā)性、隱匿性，檢測手段多樣性、不確定性以及診斷的復(fù)雜性等問題，我們應(yīng)在明確深部真菌感染診斷上形成專家共識，指導(dǎo)臨床侵襲性真菌病的早期診斷、有效治療。

4.4 檢測技術(shù)的改進(jìn)和有效資料的綜合判定

迄今為止，侵襲性真菌感染的診斷技術(shù)仍然十分有限，各種檢測方法各有優(yōu)劣，為達(dá)到早期診斷的目的，應(yīng)盡可能地聯(lián)合應(yīng)用多種檢測技術(shù)來進(jìn)行診斷。根據(jù)具體的情況，做到常規(guī)檢查與重點(diǎn)檢查相結(jié)合、傳統(tǒng)檢查與新型檢查相結(jié)合、一般檢查與特異性檢查相結(jié)合、人工檢查與系統(tǒng)分析相結(jié)合，力爭在很短的時(shí)間內(nèi)鑒定出致病真菌的種類，為臨床提供既快速又可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果。在實(shí)際的診斷中，我們應(yīng)充分利用臨床資料、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果、臨床經(jīng)驗(yàn)等有效信息做出早期的綜合判斷。把流行病學(xué)知識、循證醫(yī)學(xué)提示臨床知識總結(jié)與各種檢測手段很好結(jié)合，達(dá)到早期、快速診斷的目的。

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（收稿日期：2014-03-28）