李桂瑩，張新波，王智文，石婷，陳濤，趙學明

1天津大學化工學院，天津 300072

2系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072

3天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072

4天津城建大學環(huán)境與市政工程學院，天津 300384

5天津市水質(zhì)科學與技術(shù)重點實驗室，天津 300384

綜 述

逆向代謝工程的最新研究進展

李桂瑩1,2,3*，張新波4,5*，王智文1,2,3，石婷1,2,3，陳濤1,2,3，趙學明1,2,3

1天津大學化工學院，天津 300072

2系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072

3天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072

4天津城建大學環(huán)境與市政工程學院，天津 300384

5天津市水質(zhì)科學與技術(shù)重點實驗室，天津 300384

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，可以快速地通過基因組尺度的序列比較，來全面、系統(tǒng)地探討工業(yè)生產(chǎn)菌株和實驗室優(yōu)良菌株的遺傳基礎(chǔ)，分析基因型-表型之間的關(guān)系；同時結(jié)合準確的基因組修飾技術(shù)，完成基于全基因組突變分析的逆向代謝工程。近年來，基于全基因組突變分析的逆向代謝工程已經(jīng)成功地應用于微生物優(yōu)良菌株選育，成為了研究的前沿和熱點。綜述了近幾年逆向代謝工程發(fā)展的研究方法，突變型-表型相關(guān)性分析，逆向代謝工程的最新進展及其應用，并討論其面臨的問題及挑戰(zhàn)。

逆向代謝工程，基因型，表型，重構(gòu)

早在1996年，Baily首次對逆向代謝工程(Inverse metabolic engineering，IME) 的概念及其應用進行了詳細地闡述[1]，認為逆向代謝工程是一種有效的菌種改良策略，主要包括以下步驟：首先，鑒定、構(gòu)建或設(shè)計所需要的目標表型；其次，分析目標表型的遺傳基礎(chǔ)或環(huán)境影響因子；最后，通過直接地遺傳修飾或環(huán)境條件的改變，將目標表型賦予其他菌株或生物體。經(jīng)過近20年的發(fā)展，逆向代謝工程已在遺傳機理分析與脅迫抗性突變株的構(gòu)建[2-5]、底物利用[6-9]、生物基產(chǎn)品高產(chǎn)菌株構(gòu)建[10-13]等研究方面取得了巨大進展。

近幾年，隨著以基因組測序為代表的大規(guī)模數(shù)據(jù)產(chǎn)出和分析技術(shù)的發(fā)展[14-16]，傳統(tǒng)的生物學研究方式正在發(fā)生改變，極大加快了微生物遺傳學[17]、突變輪廓分析 (Mutational profiling)和功能基因組學的研究進程[18]，促進代謝工程研究模式的轉(zhuǎn)變[19]。高通量測序技術(shù)能夠方便快捷地獲取突變菌株基因組和轉(zhuǎn)錄組信息，使基于基因組尺度的序列比較來全面、系統(tǒng)地分析工業(yè)生產(chǎn)菌株和實驗室優(yōu)良菌株的遺傳基礎(chǔ)成為可能。通過工業(yè)菌種或優(yōu)良表型突變株比較基因組學，轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學和代謝物組學等系統(tǒng)生物學方法的聯(lián)合使用，系統(tǒng)地探明基因型-表型關(guān)系，揭示優(yōu)良表型的遺傳基礎(chǔ)，結(jié)合準確的基因組修飾技術(shù)，指導菌種代謝工程改進[18,20]，使基于全基因組突變分析的逆向代謝工程成為了研究的前沿和熱點，使逆向代謝工程進入了新的發(fā)展階段。

作為逆向代謝工程的第一個環(huán)節(jié)，鑒定或構(gòu)建優(yōu)良表型菌株方面，已有很多詳細的綜述[21-27]介紹。本文將重點介紹逆向代謝工程研究方法，突變型-表型相關(guān)性分析，逆向代謝工程的最新研究進展，并討論其面臨的問題及挑戰(zhàn)。

1 逆向代謝工程的原理與方法

目前，許多重要生物基化學品的工業(yè)生產(chǎn)菌株和實驗室構(gòu)建的優(yōu)良菌株，是通過多輪理化誘變篩選得到的。由于隨機誘變引入突變點的不確定性和隨機性，這些菌株往往具有比較復雜的遺傳背景，使得通過代謝工程進一步合理改進這些突變菌株面臨著較大的挑戰(zhàn)和困難。例如，由于隨機誘變引入突變點的不確定性，使突變株與野生株的代謝途徑存在很大的差異，基因組尺度的代謝途徑分析與in silico代謝網(wǎng)絡(luò)模型模擬的結(jié)果 (往往基于野生株的代謝網(wǎng)絡(luò)) 可能并不適用于突變株[28]。同時，大量未知突變的存在也使得對進一步理性修飾的解釋和評估變得更為復雜；另外，由于誘變的隨機性，這些突變菌株在逐漸積累和目標表型相關(guān)有利突變的過程中，也不可避免積累不利突變以及與目標表型無關(guān)的中性突變。通常情況下，積累的非有利突變遠多于有利突變[29]。同野生菌株相比，突變株大都在菌體生長速度、底物利用范圍、環(huán)境耐受性或遺傳穩(wěn)定性等方面存在缺陷[30]。由于和這些不良性狀相關(guān)的基因型通常非常復雜，通過代謝工程研究手段消除這些不良性狀面臨著巨大困難。由此，如何全面、系統(tǒng)地確定優(yōu)良突變株基因型-表型關(guān)系，探索優(yōu)良表型的遺傳調(diào)控機理，消除隨機誘變引起不良性狀的遺傳因素，是菌種改良面臨的關(guān)鍵問題。

基于全基因組突變分析的逆向代謝工程是解決上述問題的有效策略 (圖1)。首先，利用高通量基因組測序技術(shù)完成野生型菌株和優(yōu)良突變株的基因組測序或重測序，比較基因組學獲得突變信息；或者通過文庫構(gòu)建方法篩選到目的表型菌株，對特定片段進行測序，通過序列比對獲得全部突變點；其次，結(jié)合生物化學和生理學知識，或利用各種“組學”技術(shù) (轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝物組學和代謝通量組學等)，對突變進行相關(guān)性分類，確定潛在重要突變，同時把突變引入到野生型菌株中驗證突變型-表型之間的關(guān)系；最后，有利突變引入到野生型菌株中，摒棄不利突變，迭代循環(huán)操作最終構(gòu)建只含有利突變的重構(gòu)菌株，重構(gòu)菌株可以進一步通過理性代謝工程改造而改進細胞的性能。

重構(gòu)的菌株遺傳背景清晰，只攜帶與目標表型相關(guān)的有利突變，保留野生型菌株的生長良好、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)良表型，可以通過理性代謝工程進一步提高菌種性能。基于全基因組突變分析的逆向代謝工程，能夠從整個代謝網(wǎng)絡(luò)角度分析突變與表型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有利突變或突變組合；新發(fā)現(xiàn)的優(yōu)良突變還可以應用到工業(yè)菌種的改進，以及其他相關(guān)生物基產(chǎn)品的代謝工程研究。

圖1 逆向代謝工程重構(gòu)菌株流程圖Fig. 1 Workflow of strain reconstruction by inverse metabolic engineering.

2 逆向代謝工程的最新研究進展

2.1 基因型-表型相關(guān)性分析

2.1.1基于全基因組測序的基因型-表型相關(guān)性分析

構(gòu)建和鑒定特定表型是逆向代謝工程的基礎(chǔ)，全基因組范圍的基因型-表型相關(guān)性的闡釋是逆向代謝工程的關(guān)鍵。在基因型的分析方面，高通量基因組測序手段是最為直接和快捷的方式。2008年，Smith等[31]分別利用3種新一代測序技術(shù)平臺 (Roche 454 GS FLX，Illumina Solexa和Applied Biosystems SOLiD) 對產(chǎn)乙醇突變菌株樹干畢赤氏酵母Pichia stipitis Shi21進行了全基因組測序和突變分析。突變分析結(jié)果表明，3種測序平臺均準確地鑒定了14個突變。該研究同時證實，運用第二代測序平臺測定10?15倍基因組覆蓋倍數(shù)的數(shù)據(jù)，可以低成本、快速、準確地完成基因組尺度的突變點分析。隨后Darby和Hall[18]在Nature Biotechnology上撰文高度評價了Smith等的工作，提出第二代測序技術(shù)給科研工作者提供了前所未有的良好技術(shù)平臺，使基因組尺度的突變分析、轉(zhuǎn)錄組分析、表觀組學以及DNA-蛋白交互作用等成為常規(guī)研究。

隨后，基因組尺度遺傳基礎(chǔ)或機理闡釋得到了快速發(fā)展。Brown等[4]利用Roche 454 GS FLX和基于芯片的比較基因組測序方法測定了高乙醇耐受性 (80 g/L) 進化熱纖梭菌Clostridium thermocellum突變株和野生型菌株的全基因組信息。測序發(fā)現(xiàn)230個共有突變，并分析突變在基因組上的分布規(guī)律。作者發(fā)現(xiàn)在乙醇產(chǎn)生途徑中，雙功能酶乙醛-CoA/乙醇脫氫酶(AdhE)存在兩個非同義突變(Pro-704-Leu和His-734-Arg)，根據(jù)同源建模得到的突變酶AdhE*模型，Pro-704-Leu位于α-螺旋的表面，與活性位點和輔因子結(jié)合位點較遠，因此推測該突變對輔因子的結(jié)合或催化活性影響較小；His-734-Arg突變與催化活性中心和輔因子結(jié)合位點空間距離很近，而精氨酸替代組氨酸對水溶性分子交互作用和中等極性氫鍵變化的影響，對于改變輔因子的特異性是足夠的，因此推測突變酶改變了輔因子的特異性而引起該酶發(fā)揮催化功能時結(jié)合的輔酶發(fā)生改變 (NADH替換為NADPH)，輔酶的改變而造成了胞內(nèi)NADP+/NADPH比例變化，影響了其與細胞膜的相互作用，最終導致高乙醇耐受性。

Yang等[2]利用基因芯片和Roche 454 GS FLX焦磷酸測序相結(jié)合的方法，對耐乙酸產(chǎn)乙醇運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis突變株和親本菌株Zymomonas mobilis ZM4進行了基因組重測序和比較基因組分析，探討影響突變株乙酸耐受性的基因或調(diào)控機理。比較基因組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變株中nhaA基因 (編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運體) 上游序列有1.5 kb左右的片段缺失，ZMO1219 (編碼推測性的K+轉(zhuǎn)運蛋白) 和ZMO1184 (編碼假設(shè)性蛋白) 各有一個單核苷酸突變。轉(zhuǎn)錄組分析表明，nhaA基因上游大片段的缺失導致基因表達強度提高16倍之多。作者根據(jù)突變分析的結(jié)果，在野生型菌株中進行逆向代謝工程操作，敲除了nhaA基因上游1 461 bp片段后，工程菌株表現(xiàn)出耐乙酸 (NaAc 195 mmol/L，pH 5.0) 的生長特性。

國內(nèi)也有很多的課題組開展了相關(guān)的工作，中國科學院上海生命科學院的姜衛(wèi)紅和楊晟等[32]，采用相似的策略，利用Roche 454 焦磷酸測序?qū)Ω弋a(chǎn)丁醇而不產(chǎn)孢子的丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum EA 2018進行了全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組分析。比較基因組分析表明，EA 2018中含有與丁醇高產(chǎn)相關(guān)潛在重要突變 (46個缺失突變和26個插入突變)。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，spo0A和adhE2的表達水平顯著提高，而大多數(shù)酸的合成途徑相關(guān)基因表現(xiàn)為較低的表達水平。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了一個推斷性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CEA_G2622可能與木糖的快速利用相關(guān)。高產(chǎn)丁醇突變株的遺傳基礎(chǔ)闡釋以及基因型-表型關(guān)系分析，對于解釋突變株不形成孢子、高溶劑產(chǎn)生能力和木糖的快速利用等方面奠定了基礎(chǔ)，也為進一步遺傳修飾獲得高產(chǎn)菌株提供依據(jù)。

全基因組突變分析在微生物產(chǎn)生次級代謝物的基因型-表型相關(guān)性分析方面也有重要的應用。紅霉糖多胞菌是一種革蘭氏陽性絲狀細菌，工業(yè)上主要用于生產(chǎn)紅霉素A。紅霉糖多胞菌Saccharopolyspora erythraea E3是野生型菌株S. erythraea NRRL23338經(jīng)過隨機誘變后篩選得到的紅霉素A高產(chǎn)菌株。Li等[33]完成了高產(chǎn)菌株E3和野生菌NRRL23338的全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組表達分析。比較基因組結(jié)果表明，突變株E3中含有60個插入突變、46個缺失突變和584個單核苷酸突變。不同時間點的轉(zhuǎn)錄組分析表明，紅霉素A合成途徑和前體物合成途徑的基因表達水平顯著上調(diào)。而先前鑒定的ery簇調(diào)控因子BldD和ery簇基因的表達沒有顯著相關(guān)性，推測S. erythraea E3中紅霉素A的合成存在其他調(diào)控機制。紅霉素A工業(yè)化生產(chǎn)菌株與野生型菌株的功能比較基因組學研究，對于從整體上理解S. erythraea紅霉素A的合成機制，進一步利用逆向代謝工程修飾提供重要的依據(jù)。

2.1.2基于突變文庫的基因型-表型相關(guān)性分析

相對于基因組測序獲得突變型-表型之間的關(guān)系，通過文庫構(gòu)建的方法獲得優(yōu)良突變型，進一步對突變型所攜帶的文庫測序，鑒定突變型-表型之間關(guān)系，成本更低，而且能更快地發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵突變型-表型之間的關(guān)系。

Gill課題組在基因組編輯技術(shù)和逆向代謝工程方面作出了突出的成績。早在2003年，Gill就發(fā)表了利用基因組學信息進行逆向代謝工程的綜述[34]。他們開發(fā)的可追蹤多元重組工程(Trackable multiplex recombineering，TRMR)，能同時對基因組上千個位點進行分析和修飾[35]，是典型的基于突變文庫構(gòu)建研究基因型-表型相關(guān)性的案例。他們通過合成的DNA盒子，擾動大腸桿菌的啟動子和核糖體結(jié)合位點(Ribosome binding site) 序列。每個盒子中包含一個滅瘟素抗性基因 (用于重組子的篩選)、分子標簽、大腸桿菌中不同基因的同源重組序列以及擾動基因表達的序列，其中擾動基因表達的序列可以是強啟動子PLtetO-1和RBS，以提高下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，或者是通過插入序列置換基因原始的RBS序列，以降低下游基因翻譯的起始效率。Gill課題組在1周時間內(nèi)，構(gòu)建了8 154條核苷酸擾動片段，對大腸桿菌的4 077個基因分別進行基因表達的上調(diào)和下調(diào)擾動。片段轉(zhuǎn)化、重組后，抗性平板上篩選并保存轉(zhuǎn)化子。利用Affymetrix Geneflex TAG4芯片分析重組前的合成片段和重組后提取的混合細菌基因組DNA中每個分子標簽的濃度，結(jié)果顯示重組后有8 016個分子標簽的信號，即成功構(gòu)建了98% 的大腸桿菌基因表達上調(diào)或下調(diào)的文庫。為了進一步驗證TRMR方法能夠快速的鑒定突變型-表型之間的關(guān)系，他們將構(gòu)建的文庫菌株涂布到碳源分別為水楊苷、D-果糖、丙酮醛和纈氨酸的基本鹽平板上(野生型大腸桿菌不能生長)。結(jié)果顯示，文庫菌株在平板上的菌落個數(shù)是自發(fā)突變的100倍以上。作者采用TAG4芯片對所有菌落進行了分析，通過芯片數(shù)據(jù)可以根據(jù)適應度，對不同篩選條件下單個突變進行分類。同時，作者對其中的83個單菌落的分子標簽進行了測序，確定突變的基因型和適應度之間的關(guān)系，與芯片分析的結(jié)果一致。TRMR技術(shù)最大的優(yōu)勢是可以在非常短的時間內(nèi)，利用帶標簽的合成DNA，高效重組獲得上千個基因弱表達或強表達文庫，之后輔助微陣列技術(shù)就能對這些文庫進行簡單快速的追蹤，確定與表型相關(guān)的基因及其相關(guān)系數(shù)，使基因功能研究的通量提高了幾個數(shù)量級。

2013年，Woodruff等[36]采用多種組學組合運用的方法鑒定大腸桿菌突變文庫中基因型-表型的關(guān)系。他們首先采用富集文庫的多尺度分析方法(muti-Scalar Analysis of Library Enrichments, SCALEs)，構(gòu)建了約100萬個大腸桿菌文庫克隆，該方法建立的文庫數(shù)量幾乎可以在基因組尺度上分析大腸桿菌每一個基因?qū)σ掖寄褪苄缘挠绊?。利用基因組芯片和SCALEs軟件分析增強乙醇耐受性的基因及其適應度，并在野生型大腸桿菌中表達得到的14個高適應度基因，驗證引起乙醇耐受的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了尚未報道的9個基因(lpcA、arnB、arnC、tilS、yaeJ、fadE、serA、zur和yicE)能夠顯著改善乙醇存在時細胞的生長情況，其主要與細胞膜的組成、翻譯、絲氨酸的合成和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。為了進一步驗證乙醇耐受性基因和分析乙醇耐受機制，作者對乙醇耐受性最好的5株克隆進行了轉(zhuǎn)錄譜分析，利用同位素標記相對與絕對定量技術(shù)(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ)對2株乙醇耐受性克隆進行了蛋白質(zhì)組分析。轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)的分層聚類分析表明，表達譜主要分為兩個分支，含有過表達基因tilS和lpcA的克隆，其全局表達譜與宿主菌的表達譜類似；而含有過表達基因yhfUT、fadE和serA的克隆為另一簇。其中，由serA基因引起的乙醇耐受菌株，表達水平變化的基因數(shù)量最多。蛋白質(zhì)組分析表明，LpcA和TilS蛋白是表達上調(diào)程度最高的蛋白，同時lpcA過表達克隆中有17個蛋白上調(diào)22個蛋白下調(diào)，而tilS過表達克隆中有22個蛋白上調(diào)17個蛋白下調(diào)。轉(zhuǎn)錄譜和蛋白質(zhì)組分析表明，某些乙醇耐受菌株以相似的方式調(diào)控基因的全局表達，其全局表達譜的變化會有一部分的重合，然而不同乙醇耐受菌株，其在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上，重合的程度不同，且不同組學水平之間的相關(guān)系數(shù)往往較小。多種組學技術(shù)的綜合運用，能夠有力地鑒定基因型-表型的關(guān)系，特別是引起全局表達水平變化或多個基因表達水平變化的突變；此外，對于進一步闡釋突變引起表型變化的機制具有重要的意義。

隨后，Woodruff等[37]采用類似方法構(gòu)建和篩選具有乙醇耐受性、生長迅速且高產(chǎn)乙醇的文庫菌株，鑒定相關(guān)表型的遺傳基礎(chǔ)，并對已鑒定基因進行組合優(yōu)化，考察不同組合對目標表型的影響，發(fā)現(xiàn)過表達otsA基因能顯著提高乙醇耐受性和乙醇生產(chǎn)率。Hong等[38]采用基因組文庫構(gòu)建的方法，鑒定了釀酒酵母基因組中引起乙醇耐受性改進的基因修飾位點。在基因組尺度上共鑒定了4個基因(INO1、DOG1、HAL1和MSN2)，其中，INO1的過表達不僅能夠提高乙醇耐受性，還可以使宿主菌在高濃度糖(10%)和乙醇(5%)的培養(yǎng)基中，比生長速率提高3倍。

雖然基于文庫構(gòu)建的方法鑒定基因型-表型關(guān)系成本相對較低，能較快地鑒定重要突變，但是突變庫的構(gòu)建相對繁瑣，受到高通量篩選方法的限制，且往往不能包含基因組的全突變信息，具有一定局限性。

2.2 逆向代謝工程的應用

2.2.1提高底物利用效率

通過逆向代謝工程提高底物的利用效率主要有兩種方式：一是通過進化工程，激活潛在的代謝途徑，使細胞能夠利用新的底物并提高底物的利用效率；或者通過進化工程提高天然底物的利用效率，獲得優(yōu)良突變株，進一步通過基因型-表型關(guān)系分析，得到逆向代謝工程的操作靶點，此方面的研究進展主要集中在木糖[39]和半乳糖[40]等底物利用，以及非天然底物[41]或甘油[42-44]等重要工業(yè)副產(chǎn)物等的利用；其次是在異源微生物或相關(guān)模式系統(tǒng)中得到高效利用底物表型，然后通過基因組測序或其他“組學”技術(shù)分析其遺傳基礎(chǔ)，得到關(guān)鍵代謝途徑、酶基因，進一步在特定微生物中通過遺傳修飾提高底物的利用效率[9]。

Palsson課題組在利用高通量測序技術(shù)分析進化菌株的基因型-表型關(guān)系，進而指導逆向代謝工程研究方面作了出色工作[45,41]。Lee和Palsson[41]對E. coli K12 MG1655菌株在以1,2-丙二醇為唯一碳源的基本鹽培養(yǎng)基上進行700代適應性進化，篩選獲得的進化菌株不僅能在1,2-丙二醇為唯一碳源和能源的基本培養(yǎng)基上正常生長，且比生長速率達到0.35/h；進一步通過Illumina Solexa全基因組測序和比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)進化過程中積累了6個突變 (5個突變位于編碼區(qū)，1個突變位于非編碼區(qū))，作者通過基因吞噬 (Gene gorging) 技術(shù)和λ-Red重組系統(tǒng)將突變點引入野生型菌株，考察每一個突變點對進化表型的貢獻度，最終將全部有利突變引入到野生型菌株中，構(gòu)建了一株表型與進化菌株幾乎相同的工程菌株?；诨蚪M測序的突變分析結(jié)合有效的基因操作手段，分析突變型與表型的相關(guān)性，重構(gòu)只含有利突變的目標表型工程菌株。

將異源微生物的表型賦予特定微生物方面，通過逆向代謝工程使釀酒酵母代謝木糖是比較成功的案例。釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae不能利用木糖作為碳源，而樹干畢赤酵母Pichia stipitis天然能夠代謝木糖[46]，P. stipitis基因組測序闡明了木糖代謝途徑[47]，作者將其木糖代謝途徑引入至釀酒酵母細胞中，使其能夠利用木糖合成乙醇。然而，厭氧條件下外源木糖代謝途徑輔因子不平衡，釀酒酵母生長緩慢[48]。為進一步理解木糖利用的代謝機制和逆向代謝工程修飾，Wohlbach等[9]最近對兩株天然利用木糖的甲蟲關(guān)聯(lián)酵母Spathaspora passalidarum和纖維假絲酵母Candida tenuis進行基因組測序，并對現(xiàn)有的14株子囊菌基因組進行了比較基因組學分析，根據(jù)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹進行基因型-表型的比對分析，同時檢測了5株具有不同木糖利用能力的半子囊菌的基因表達情況，發(fā)現(xiàn)了促進木糖利用的潛在基因 (10個)。在釀酒酵母中分別表達來自C. tenuis醛酮還原酶 (CtAKR) 和S. passalidarum未注釋蛋白 (SpNA) 能夠特異性提高木糖利用效率。好氧或厭氧條件下CtAKR的過表達均能夠顯著提高木糖的利用效率，其中厭氧條件下，發(fā)酵72 h木糖利用率提高了32%，同時副產(chǎn)物甘油和乙酸的積累分別降低了73%和42%。

2.2.2增強環(huán)境脅迫能力

環(huán)境脅迫是指不利于細胞生長的外部環(huán)境因素，如抗生素、毒性化學物質(zhì)、極端溫度、pH或營養(yǎng)限制等。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，微生物細胞會面臨多種脅迫作用如酸脅迫、高溫脅迫、滲透壓脅迫等。脅迫誘導的基因調(diào)節(jié)，有可能影響細胞的許多重要生理功能，進而影響生物轉(zhuǎn)化效率，因此選擇生產(chǎn)性能良好、對發(fā)酵過程中的主要脅迫因素有較強耐受性的菌株至關(guān)重要。付瑞艷和李寅[25]對利用代謝工程提高工業(yè)微生物脅迫抗性作了系統(tǒng)地論述。工業(yè)化生產(chǎn)過程中，為了追求產(chǎn)品的高得率和高產(chǎn)量，需要較高的底物和目標產(chǎn)品濃度，特別是在生產(chǎn)醇類 (如乙醇、丁醇和異丁醇) 以及氨基酸和有機酸 (如琥珀酸、乳酸、乙酸和蘋果酸) 等物質(zhì)，提高菌株對底物和產(chǎn)物的耐受性尤為重要。強耐受性菌株的發(fā)酵過程能夠大大簡化產(chǎn)品的下游處理過程，增加了產(chǎn)品濃度，降低成本[49]。

相對于乙醇，高級醇 (三碳或更高碳鏈醇)更適合作為液體燃料，其具有更高的能量密度，更低的蒸發(fā)壓和更低的親水性。近幾年，1-丙醇、1-丁醇、異丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇等相繼通過代謝工程在大腸桿菌中合成出來。值得一提的是，大腸桿菌異丁醇的發(fā)酵產(chǎn)量已經(jīng)超過20 g/L[11]。雖然異丁醇的生產(chǎn)在細胞生長停止后仍然繼續(xù)進行，但是8 g/L的異丁醇對細胞生長就有抑制作用。所以，提高菌體對異丁醇的耐受性是提高異丁醇產(chǎn)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

Liao課題組的工作[3]具有很好的代表性，首先他們通過進化工程的方法得到了異丁醇耐受菌株大腸桿菌SA481，利用Solexa測序平臺對出發(fā)菌株JCL260和突變株SA481進行全基因組測序，并進行了比較基因組分析，獲取進化菌株的突變信息。與JCL260相比，SA481含有1個SNP、25個插入突變和一段含有62個基因的大片段缺失。為了識別異丁醇耐受性關(guān)鍵突變點，作者對SA481中的突變進行了單回復突變和不同組合的回復突變，絕大部分單回復突變會降低菌株的異丁醇耐受度，但是沒有任何單回復突變可以完全破壞菌株的耐受度，而acrA、yhbJ和大片段缺失的回復可以顯著降低異丁醇耐受度。組合回復結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中的5個突變組合回復后獲得的突變株TW313，其生長速度與出發(fā)菌株JCL260基本相同。作者在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上，進行了菌株重構(gòu)，構(gòu)建了高異丁醇耐受性的突變株TW306，8 g/L的異丁醇耐受性檢測顯示，出發(fā)菌株JCL260完全停止了生長，SA481和TW306則可以繼續(xù)生長，同時生產(chǎn)異丁醇，這表明提高異丁醇耐受度可以改善異丁醇脅迫壓力下菌體生長和異丁醇生產(chǎn)能力，成功地通過逆向代謝工程方法在大腸桿菌中重構(gòu)高異丁醇耐受的復雜表型。

2.2.3構(gòu)建生物基產(chǎn)品高產(chǎn)菌株

逆向代謝工程構(gòu)建高產(chǎn)菌株方面，Stephanoplous課題組構(gòu)建的產(chǎn)L-酪氨酸大腸桿菌重構(gòu)菌株是非常成功的案例[12]。他們首先通過全局轉(zhuǎn)錄機器工程 (global Transcription Machinery Engineering，gTME)，構(gòu)建了105?106的大腸桿菌文庫，從中篩選到了3株L-酪氨酸增產(chǎn)菌株 (rpoA14、rpoA27和rpoD3)，其L-酪氨酸的產(chǎn)量比宿主菌提高了91%?113%。進一步分析了不同突變質(zhì)粒與遺傳背景之間的關(guān)聯(lián)性，并通過轉(zhuǎn)錄組分析了不同基因的表達情況，探討突變型的遺傳基礎(chǔ)和L-酪氨酸的高產(chǎn)機制。通過突變株的全基因組測序和比較基因組學分析，鑒定出3株高產(chǎn)菌株中引起L-酪氨酸高產(chǎn)的突變基因。3個突變菌株中，每個菌株僅發(fā)生了一個單堿基突變(hisH L82R、purF V5G和purF上游17 bp處T突變?yōu)镃)，最后他們將突變整合到宿主菌中，得到遺傳背景清晰的工程菌rpoA14R。搖瓶發(fā)酵檢測，L-酪氨酸產(chǎn)量高達902 mg/L，得率為0.18 g酪氨酸/g 葡萄糖，是工業(yè)化生產(chǎn)菌株的1.5倍，達到理論得率的85%。2 L發(fā)酵罐中，L-酪氨酸的生產(chǎn)率為2.1 g/(L?h)，36 h產(chǎn)量達到13.8 g/L，生長速率為0.405/h。逆向代謝工程不僅構(gòu)建了高產(chǎn)菌株，降低了工業(yè)化生產(chǎn)成本，而且進一步闡釋了L-酪氨酸合成的遺傳機制。

近來，基于全基因組突變分析的逆向代謝工程在三萜烯β-香樹精[50]、重組蛋白[13]和N端糖基化蛋白[51]高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方面均有成功的報道。我們研究組也正在開展基于高產(chǎn)核黃素突變菌株全基因組突變分析的逆向代謝工程研究，利用Roche 454 GS FLX技術(shù)對兩株核黃素高產(chǎn)菌株進行了全基因組測序和突變分析，兩株菌均發(fā)現(xiàn)了超過500個的單核苷酸突變，通過無痕重組技術(shù)已經(jīng)對超過30個突變基因及其組合進行了表型分析，在野生型菌株中初步構(gòu)建了重構(gòu)菌株。

3 展望

從近幾年的研究可以看出，基于基因組測序的突變分析在連接基因型-表型關(guān)系，闡釋優(yōu)良表型的遺傳調(diào)控機理，改進工業(yè)化生產(chǎn)菌株性能方面顯示了巨大的應用潛力。由中國科學院微生物研究所牽頭的“十二五”863計劃“工業(yè)微生物基因組及分子改造”，擬從工業(yè)微生物的應用基因組科學出發(fā)，建立我國重要工業(yè)生產(chǎn)菌種的基因組數(shù)據(jù)庫，利用微生物分子改造技術(shù)，針對氨基酸、維生素、抗生素、發(fā)酵食品等產(chǎn)品，研發(fā)新一代工業(yè)菌株(http://www.cncbd.org.cn/)。

基因組尺度的突變分析，結(jié)合有效的基因操作手段，可以分析突變型與表型的相關(guān)性，重構(gòu)只含有利突變的目標表型工程菌株。而且，全基因組突變分析和重要突變點的深入研究，不僅能夠闡釋突變引起表型變化的機理，還可為解釋某些復雜表型的調(diào)控機制提供依據(jù)，為相關(guān)生物基產(chǎn)品的代謝工程提供修飾靶點?；蚪M尺度的突變分析具有全面、系統(tǒng)的特點，利用全基因組突變分析，闡釋生物基產(chǎn)品高產(chǎn)表型的遺傳基礎(chǔ)或代謝調(diào)控機制是重要的發(fā)展趨勢，逆向代謝工程必將為新一代工業(yè)化菌株的改良作出重大貢獻。

基于全基因組突變分析的逆向代謝工程面臨的挑戰(zhàn)之一，是如何從大量的突變信息中“沙里淘金”，得到與表型正相關(guān)的突變及其突變組合。特別對于經(jīng)過誘變、篩選得到的目標表型菌株，可能會含有數(shù)百甚至上千個突變。各種“組學”和生物信息學技術(shù)是對突變點進行分類，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵突變點，特別是引起全局調(diào)控變化的突變的重要工具。此外，隨著基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的快速發(fā)展，結(jié)合不同的代謝網(wǎng)絡(luò)和菌株優(yōu)化算法，如MOMA、FBA、OptKnock和OptGene等[52]，可以預測某些表型修飾的靶目標基因，將突變信息與預測的靶目標基因組合分析，有助于快速發(fā)現(xiàn)有利突變或突變組合。一旦確定了關(guān)鍵(突變)基因之后，下一步的任務是如何調(diào)控和優(yōu)化不同的基因組合和表達水平。筆者認為逆向代謝工程面臨的另一挑戰(zhàn)，是如何將有利突變信息進行合理地組合，進而得到表型優(yōu)良的重構(gòu)菌株。因為代謝網(wǎng)絡(luò)復雜調(diào)控關(guān)系，某些復雜表型如生長和產(chǎn)品的高產(chǎn)，往往需要多基因不同表達水平的組合，以及基因“異位顯性”等因素的存在，逆向代謝重構(gòu)過程中需要考慮途徑內(nèi)突變基因的組合，以及不同代謝或調(diào)控途徑內(nèi)突變的組合。因此，快速構(gòu)建不同基因表達水平組合的多重自動基因組編輯技術(shù)是未來發(fā)展的重要趨勢，也是代謝工程和逆向代謝工程的強有力工具。

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(本文責編 陳宏宇)

Progress in inverse metabolic engineering

Guiying Li1,2,3*, Xinbo Zhang4,5*, Zhiwen Wang1,2,3, Ting Shi1,2,3, Tao Chen1,2,3, and Xueming Zhao1,2,3

1 School of Chemical Engineering & Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China
2 Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Tianjin 300072, China
3 Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin), Tianjin 300072, China
4 School of Environmental and Municipal Engineering, Tianjin Chengjian University, Tianjin 300384, China
5 Tianjin Key Laboratory of Aquatic Science and Technology, Tianjin 300384, China

In the last few years, high-throughput (or ‘next-generation’) sequencing technologies have delivered a step change in our ability to sequence genomes, whether human or bacterial. Further comparative genome analysis enables us to reveal detailed knowledge of genetics or physiology of industrial important strains obtained in laboratory, to analyze genotype-phenotype correlations of mutants with improved performance. Based on identified key mutations or mutation combinations, Inverse Metabolic Engineering (IME) can be performed by using accurate genetic modification system. Recently, IME has been successfully used for strain improvement and has become a research hotspot, including improving substrate utilization, engineering the robustness of industrial microbes and enhancing production of bio-based products. Here, we describe recent advances in research methods of IME, with an emphasis on characterization of genotype-phenotype and the latest advances and application of IME. Possible directions and challenges for further development of IME are also discussed.

inverse metabolic engineering, genotype, phenotype, reconstruction

November 25, 2013; Accepted: January 14, 2014

Zhiwen Wang. Tel/Fax: +86-22-27406582; E-mail: zww@tju.edu.cn

李桂瑩, 張新波, 王智文, 等. 逆向代謝工程的最新研究進展. 生物工程學報, 2014, 30(8): 1151?1163.

Li GY, Zhang XB, Wang ZW, et al. Progress in inverse metabolic engineering. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1151?1163.

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. 2011CBA00804, 2012CB725203), National Natural Science Foundation of China (Nos. 21206112, 21176182, 51308373), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2012AA022103, 2012AA02A702), the Innovation Foundation of Tianjin University (No. 1308).

* These authors contributed equally to this study.

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973 計劃) (Nos. 2011CBA00804, 2012CB725203)，國家自然科學基金 (Nos. 21206112, 21176182, 51308373)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863 計劃) (Nos. 2012AA022103, 2012AA02A702)，天津大學自主創(chuàng)新基金 (No. 1308) 資助。網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-03-25 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130597.html