王曉花，章建程，王慶敏，李中付，周宏元，袁海霞

·論著·

白細胞介素-1對新生大鼠內(nèi)耳毛細胞再生能力的影響

王曉花，章建程，王慶敏，李中付，周宏元，袁海霞

目的 通過在新生SD大鼠毛細胞培養(yǎng)液中加入P27抑制劑白細胞介素-1(IL-1)，觀察IL-1介導(dǎo)的細胞周期蛋白依賴性激酶/細胞周期蛋白D(CDK4/cyclinD)復(fù)合體表達增強對毛細胞再生能力的影響。方法 提取16只7 d齡SD大鼠的內(nèi)耳基底膜上皮細胞層，按數(shù)字表法隨機分為對照組(8只)和IL-1組(8只)，離體培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)第7天、第14天細胞生長情況，通過免疫組織化學(xué)方法檢測毛細胞內(nèi)CDK4、cyclinD的表達。結(jié)果 培養(yǎng)第7天，40倍光鏡下3個隨機視野內(nèi)IL-1組毛細胞細胞球數(shù)量(139.33±13.50)個，與對照組［(69.00±12.49)個］相比明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);培養(yǎng)第14天，毛細胞細胞球數(shù)量仍然有增多趨勢，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，IL-1組毛細胞內(nèi)CDK4和cyclinD表達增強，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);CDK4和cyclinD陽性細胞率［分別為(48.23± 8.87)%和(28.43±1.34)%］增高，與對照組［分別為(35.03±1.94)%和(17.43±2.20)%］相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 IL-1可能對新生大鼠毛細胞的再生有一定的促進作用。

毛細胞;再生;離體培養(yǎng);白細胞介素-1

近年來有文獻報道，新生SD大鼠耳蝸內(nèi)存在一種具有高度自我增殖能力的細胞，體外培養(yǎng)下可以誘導(dǎo)分化為具有毛細胞和神經(jīng)元標(biāo)志物的細胞。周期依賴性蛋白激酶抑制因子p27選擇性地表達于支持細胞表面，抑制支持細胞的分化。同時，p27作為細胞周期負性調(diào)控因子，與細胞周期蛋白(cyclin)相互競爭結(jié)合細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclindependent kinase，CDK)，從而抑制細胞周期正性調(diào)控蛋白cyclin-CDK全酶的活性［1-2］。cyclin-CDK2和cyclin-CDK4復(fù)合體是細胞周期中催化細胞由G1期進入S期的關(guān)鍵酶，能夠抑制Rb蛋白的功能。Rb基因編碼的核內(nèi)磷酸化蛋白Rb對毛細胞細胞周期有抑制作用，如果有效關(guān)閉該基因，則可促使毛細胞自身分裂。本實驗通過在新生SD大鼠毛細胞培養(yǎng)液中加入P27的抑制劑白細胞介素-1(IL-1)，通過降低毛細胞內(nèi)P27的表達，從而促進支持細胞轉(zhuǎn)化為毛細胞;同時增強cyclin-CDK4復(fù)合體的表達，抑制Rb蛋白的功能，促進毛細胞自身分裂，觀察IL-1對毛細胞再生能力的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SD大鼠16只，鼠齡7 d，由海軍醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供。按數(shù)字表法隨機分為2組:對照組(8只)，提取耳蝸毛細胞，在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng);IL-1組(8只)，提取耳蝸毛細胞，在無血清培養(yǎng)液中加IL-1(10μg/L)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 (1)主要試劑:IL-1 (Shenandoah公司)，10μg/L;DMEM/F12培養(yǎng)液(Invitrogin公司);B27 supplement(Invitrogin公司); bFGF，20μg/L(Invitrogin公司);EGF，20μg/L(Invitrogin公司);青霉素G(Sigma P-7794)，2.5mg;多聚賴氨酸(SIGMA公司);0.125%的胰蛋白酶(SIGMA公司);4%多聚甲醛(SIGMA公司);羊抗小鼠的二抗FITC(DSHB公司);CyclinD抗體(Santa Cruz公司);CDK4抗體(Santa Cruz公司)。(2)消化酶溶液的配制:將嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin，Sigma公司)溶于pH 7.4的D-Hank溶液中，濃度為0.5 g/L。(3)無血清培養(yǎng)液成分:DMEM/F12培養(yǎng)液、B27 supplement、bFGF(20μg/L)、EGF(20μg/L)、青霉素G 2.5 mg。(4)主要儀器:解剖顯微鏡、尼康DIAPHOT倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡;Bio Photometer分光光度計(美國Eppendorf)、高速離心機、5%CO2培養(yǎng)箱。

1.3 耳蝸基底膜上皮層的分離與毛細胞培養(yǎng) 先用75%乙醇浸泡出生后7 d的2組大鼠進行消毒，然后將大鼠斷頭，完整取出聽泡，置于0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中。在顯微鏡下打開聽泡，小心地剝離蝸殼。由于新生的大鼠耳蝸尚未骨化，僅為軟骨組織，可以完整地去除骨性耳蝸。去除螺旋韌帶，自基底膜底轉(zhuǎn)完整撕下基底膜，放入含有0.5 g/L嗜熱菌蛋白酶的D.Hank溶液中，于體積分數(shù)為0.05的CO2孵箱(37℃)內(nèi)進行25 min酶消化。酶消化后，耳蝸上皮組織和結(jié)締組織之間的結(jié)合會變得較為疏松，在高倍顯微鏡下，用超細鎢絲刀將包括大上皮嵴、小上皮嵴、內(nèi)毛細胞和外毛細胞在內(nèi)的一層大鼠耳蝸基底膜上皮層組織自基底膜上鏟下。再經(jīng)過0.125%的胰蛋白酶消化15 min，用含有10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液終止消化，1 500 r/min離心3 min(離心半徑3 cm)，棄上清，用配好的2ml無血清培養(yǎng)液重懸細胞。接種至直徑35mm的培養(yǎng)皿中，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

細胞懸浮培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)期間隔天換液，每日在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)基顏色、透明度及細胞生長情況。第14天計數(shù)結(jié)束后，將懸浮培養(yǎng)的細胞貼壁培養(yǎng)7 d:培養(yǎng)皿中放入蓋玻片，涂抹多聚賴氨酸，將細胞懸液滴在蓋玻片上，待24 h后，懸浮的細胞球基本貼緊玻片后，加入含10%FBS的培養(yǎng)液，隔天換液，第7天固定染色。

1.4 細胞球計數(shù) 按前述的耳蝸分離與細胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)至第7天和第14天，在低倍(40倍)倒置相差顯微鏡下，隨機取3個視野進行細胞球計數(shù)。計數(shù)標(biāo)準(zhǔn):(1)細胞球的形態(tài)為圓形或橢圓形;(2)細胞球直徑在1.0 cm或以上;(3)如2個或數(shù)個細胞球重疊在一起，則按1個細胞球計數(shù);(4)僅計數(shù)懸浮的細胞球，貼壁的細胞球不計入。

1.5 cyclinD、CDK4的檢測 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接(SP)免疫組織化學(xué)方法。具體操作步方法:細胞甩片經(jīng)3 ml/L Triton X-100/PBS、10 ml/L H2O2/PBS處理后，用正常兔血清封閉，37℃溫育 30 min。分別滴加兔抗大鼠 cyclinD (1∶100)和CDK4(1∶100)多抗(一抗)，4℃過夜。次日晨滴加山羊抗兔IgG血清(1∶200，二抗)，37℃溫育30 min。滴加SP復(fù)合物，37℃溫育30 min(以上各步間均以PBS充分振洗)。DAB顯色，室溫5 min，PBS振洗中止顯色反應(yīng)，蘇木精襯染，逐級乙醇脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片;陰性對照用PBS代替一抗，其他同前。

1.6 結(jié)果判定 cycinD陽性著色定位于細胞核，CDK4陽性著色定位于細胞核和細胞質(zhì)，以細胞中相應(yīng)部位出現(xiàn)紅色或綠色顆粒為陽性細胞。每張片選擇5個典型的高倍(200倍)視野，計數(shù)至少500個細胞，并計數(shù)5個視野中的細胞總數(shù)及陽性細胞數(shù)，然后計算出每張片的陽性細胞百分率(參考:陽性細胞率≥10%為陽性，＜10%為陰性)。

2 結(jié)果

40倍光鏡下，培養(yǎng)第7天IL-1組毛細胞細胞球數(shù)量增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);培養(yǎng)第14天，毛細胞細胞球數(shù)量仍存在增多趨勢，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。免疫組織化學(xué)測定結(jié)果顯示，IL-1組CDK4和cyclinD陽性細胞率增多，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);且熒光強度(以單位面積內(nèi)光密度IOD/area計)增強，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。顯微鏡下毛細胞內(nèi)綠色為CDK4陽性表達，紅色為cyclinD陽性表達。結(jié)果見表1及圖1、2。

圖1 2組懸浮培養(yǎng)14 d和貼壁培養(yǎng)7 d后CDK4表達組織圖(免疫組化 ×200)

3 討論

內(nèi)耳毛細胞是機械-電感受器，對維持聽覺和平衡覺起著關(guān)鍵作用。任何原因?qū)е碌膬?nèi)耳毛細胞的變性、壞死均可引起聽覺和平衡功能障礙［3-6］。因此，對內(nèi)耳毛細胞的再生研究一直是重點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，將新生大鼠耳蝸Corti器進行體外細胞培養(yǎng)，可見細胞球形成，且細胞球內(nèi)細胞能被Brdu標(biāo)記，認為其內(nèi)存在一種增殖細胞，該增殖細胞存在于基底膜的大上皮嵴區(qū)域，可以誘導(dǎo)分化為具有毛細胞和神經(jīng)元標(biāo)志物的細胞。

圖2 2組懸浮培養(yǎng)14 d和貼壁培養(yǎng)7 d后cyclinD表達組織圖(免疫組化 ×200)

內(nèi)耳毛細胞發(fā)育、分化及再生機制的研究，因內(nèi)耳結(jié)構(gòu)復(fù)雜、部位深在、組織來源少、分離出的組織對環(huán)境變化敏感、活性難以保持而受到一定限制。體外組織細胞培養(yǎng)條件下的實驗研究避免了全身因素的干擾和影響，使實驗條件更加純化，有利于研究組織細胞在單因素改變下的變化規(guī)律和變化機制，研究途徑更為便捷可靠［7］。一般認為，哺乳動物的毛細胞是一種高度分化和穩(wěn)定的感覺細胞，具有恒定的DNA總量，通常不再具有分裂增殖能力，因此毛細胞的離體培養(yǎng)較其他組織細胞的培養(yǎng)技術(shù)具有更高的要求和難度［8-9］。耳蝸器官培養(yǎng)的材料大多采用出生數(shù)天的小鼠或者大鼠，主要是因為小鼠和大鼠在出生后數(shù)天尚未完全骨化，比較容易對耳蝸內(nèi)結(jié)構(gòu)進行分離和取材。同時此階段小鼠和大鼠的耳蝸細胞尚未發(fā)育完全處于比較原始階段，因此比較容易培養(yǎng)成功［10-11］。

本實驗提取了新生大鼠耳蝸基底膜上皮細胞，進行離體培養(yǎng)，觀察IL-1對新生大鼠毛細胞再生能力的影響。結(jié)果顯示:培養(yǎng)第7天，IL-1組毛細胞細胞球數(shù)量與對照組相比明顯增多;培養(yǎng)第14天，毛

表1 2組毛細胞培養(yǎng)不同時間后細胞球數(shù)量及免疫組織化學(xué)測定結(jié)果(±s，每組n=8)

表1 2組毛細胞培養(yǎng)不同時間后細胞球數(shù)量及免疫組織化學(xué)測定結(jié)果(±s，每組n=8)

注:IL-1為白細胞介素-1;CDK4為細胞周期蛋白依賴性激酶;cyclinD為細胞周期蛋白D;IOD/area為單位面積內(nèi)光密度值。與對照組比較aP＜0.05

組別 細胞球數(shù)量(個)第7天 第1 4天C D K 4熒光強度( I O D / a r e a ) C D K 4陽性細胞率( % ) c y c l i n D熒光強度( I O D / a r e a ) c y c l i n D陽性細胞率( % ) a對照組 6 9.0 0 ± 1 2.4 9 3 8.0 0 ± 9.5 4 6 2.9 2 ± 8.5 3 3 5.0 3 ± 1.9 4 6 7.0 1 ± 5.9 2 1 7.4 3 ± 2.2 0 I L -1組 1 3 9.3 3 ± 1 3.5 0a4 1.0 0 ± 6.2 5 7 6.7 7 ± 6.4 9a4 8.2 3 ± 8.8 7a7 7.0 4 ± 7.8 9a2 8.4 3 ± 1.3 4

細胞細胞球數(shù)量仍然有增多趨勢，且免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，毛細胞CDK4和cyclinD表達增強，CDK4和cyclinD陽性細胞率增高。這一結(jié)果初步說明，IL-1對新生大鼠毛細胞的再生可能有一定的促進作用?？赡軝C制:IL-1通過抑制周期依賴性蛋白激酶抑制因子p27的表達，一方面促進了支持細胞分化為新的毛細胞;另一方面促進cyclin/CDK4復(fù)合體的表達，抑制了Rb蛋白的功能，催化毛細胞由G1期進入S期，促使毛細胞自身分裂。在培養(yǎng)第14天，IL-1組毛細胞細胞球數(shù)量與對照組相比呈增多趨勢，可能原因為毛細胞周期中潛伏期約48 h，倍增時間24～36 h，指數(shù)增生期持續(xù)2～4 d，培養(yǎng)1周后，毛細胞細胞球達80%融合，而后增殖能力受到一定的抑制，該細胞具有接觸抑制能力。

內(nèi)耳毛細胞的發(fā)育和再生是一個復(fù)雜的問題，研究人員一直在探索通過外源性的生長因子或通過基因治療的辦法來解決損傷后毛細胞再生的問題。經(jīng)過各國學(xué)者20多年的研究，在毛細胞再生方面已取得了突破性的進展，如果基因治療臨床應(yīng)用成功，將會有效解決因為毛細胞的變性壞死導(dǎo)致的聽力障礙和平衡功能障礙。

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Effect of IL-1 on the regeneration of the inner ear hair cells in newborn rats

WANG Xiao-hua，ZHANG Jian-cheng，WANG Qing-min，LIZhong-fu，ZHOU Hong-yuan，YUAN Hai-xia

(Naval Medical Research Institute，Shanghai200433，China)

Objective To observe the effectof enhanced expression of CDK4/cyclinD complex on the regeneration of hair cells in newborn rats through addition of P27 inhibitor IL-1 into the culture.Methods The epithelium collected from the supportingmembrane of the inner ear in the 167 day old ratswere cultured in vitro and the animalswere divided into 2 groups:the blank control group and the IL-1 group，each consisting of8 rats.Cell growth was observed respectively at day 7 and day 14，and the expressions of CDK4 and cyclinD in hair cells were detected by immunohistochemistry.Results At day 7 after culture，the number of cell balls of hair cells(139.33± 13.50)in the IL-1 group increased significantly in 3 randomized visual fields under the electron lightmicroscope，when itwas compared with that of the blank control group(69.00±12.49)，and statistical significance could be noticed，when comparisonsweremade between them(P＜0.05).At day 14 after culture，the number of cell balls of hair cells still displayed an increasing trend，butwithout statistical significance(P＞0.05).Immunohistochemistry revealed that the expressions of CDK4 and cyclinD(76.77±6.49 and 77.04±7.89)in hair cells of the IL-1 group were enhanced，butwithout statistical significance(P＞0.05)，as compared with those of the control group (P＞0.05).Positive rates of CDK4 and cyclinD were respectively increased(48.23±8.87 and 28.43±1.34)，and statistical significance could be seen，as compared with those［(35.03±1.94)%and(17.43±2.20)%］of the control group，with statistical significance(P＜0.05).Conclusion IL-1might have a certain enhancing effect on the regeneration of hair cells in newborn rats.

Hair cell;Regeneration;In vitro culture;IL-1

R764

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2014.05.004

2013-09-12)

(本文編輯:施 莼)

200433 上海，海軍醫(yī)學(xué)研究所