張雪榮 李云海

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)金匱教研室，武漢430061）

腎敷靈外敷配合雷公藤多甙對難治性腎病大鼠腎組織炎癥因子NF-κB及TGF-β的影響

張雪榮 李云海

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)金匱教研室，武漢430061）

目的觀察腎敷靈外敷配合雷公藤多甙對難治性腎病大鼠的炎癥因子NF-κB及TGF-β的影響。方法按照隨機(jī)化的原則分為4組：正常組、模型組、對照組、治療組，實(shí)驗(yàn)第7天開始灌胃，正常組、模型組每天灌胃生理鹽水；對照組每天灌胃雷公藤多甙混懸液；治療組在對照組治療基礎(chǔ)上外敷腎敷靈于大鼠神闕、腎腧、脾腧穴位。實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)開始后2周、4周收集大鼠24小時尿液檢測24小時尿蛋白定量；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后Western Blot方法檢測腎組織中NF-κB、TGF-β的水平。結(jié)果實(shí)驗(yàn)第14天、28天，模型組、對照組及治療組大鼠24h尿蛋白顯著高于正常組；與模型組相比，對照組及治療組24h尿蛋白量均顯著受到抑制（P＜0.01）；治療組24h尿蛋白量28天低于對照組（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)第28天，與正常組相比，模型組、對照組、治療組大鼠腎組織中NF-κB、TGF-β的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，對照組及治療組明顯降低（P＜0.01）；其中NF-κB的水平治療組則明顯低于對照組（P＜0.01）。結(jié)論腎敷靈外敷配合雷公藤多甙可通過抑制NF-κB、TGF-β表達(dá)，減輕難治性腎病大鼠腎小球的炎癥反應(yīng)，從而抑制腎小球的損傷。

難治性腎??；腎敷靈；NF-κB；TGF-β；中藥外治

“難治性”腎病國外［1］統(tǒng)稱復(fù)發(fā)性腎?。≧NS），是指除外繼發(fā)性腎病，而屬原發(fā)性腎病者，約占小兒原發(fā)性腎病10%。我國臨床上常對下述情況稱之“難治性腎病”：激素耐藥即指經(jīng)潑尼松足量正規(guī)治療8周無效應(yīng)，尿蛋白仍≥+++，或部分效應(yīng)，尿蛋白仍+～++；頻繁復(fù)發(fā)即指半年內(nèi)復(fù)發(fā)2次或1年內(nèi)復(fù)發(fā)3次者；激素依賴即指用藥后緩解，減量或停藥后4周內(nèi)復(fù)發(fā)，恢復(fù)用藥仍有效，并重復(fù)3次以上者。本病多見于3～7歲兒童，多數(shù)患兒預(yù)后良好，少數(shù)患兒因其反復(fù)發(fā)作，病程長或激素及細(xì)胞毒類藥物的副作用等，嚴(yán)重影響兒童身心健康。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)用動物：4～5周齡雄性SPF級健康雌性SD大鼠40只，體重130～150g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。喂養(yǎng)一周后，開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

1.2.1 腎敷靈腎敷靈的制備在湖北省中醫(yī)院制劑室完成，方法：將黃芪、仙茅、肉蓯蓉、吳茱萸、川芎混合研磨成80目粉末，加生姜汁及1%～2%促皮滲透劑水溶性桂氮酮，少許甘油，調(diào)成膏狀，密封在冰箱里。

1.2.2 雷公藤多甙片貴州漢方制藥有限公司，10mg／片，國藥準(zhǔn)字：Z52020369，批號：110401。

1.2.3 注射用鹽酸多柔比星（阿霉素）浙江海正藥業(yè)股份有限公司，10mg／瓶，國藥準(zhǔn)字：H20041318，批號：101101。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑一抗：actin兔來源抗體，Santa公司，貨號：Sc-1616r，分子量：43KD；NF-κB兔來源抗體，Santa公司，貨號：sc-114，分子量：50KD；TGF-β兔來源抗體，Santa公司，貨號：sc-146，分子量：25KD。二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗兔。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大鼠阿霉素腎病模型的建立給造模組大鼠尾靜脈一次性注射阿霉素6.0mg／kg（阿霉素按2mg／ml溶于生理鹽水中，即3.0ml／kg）；正常組大鼠尾靜脈一次注射生理鹽水3.0ml／kg。

1.4.2 動物分組按照隨機(jī)化的原則進(jìn)行分組：正常組、模型組、對照組（雷公藤多甙灌胃）、治療組（腎敷靈外敷加口服雷公藤多甙灌胃），各組大鼠均為10只。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)藥品配置將阿霉素注射液、雷公藤多甙均用生理鹽水配成2mg／ml的濃度。

1.4.4 給藥劑量實(shí)驗(yàn)第7天開始灌胃，給藥均現(xiàn)用現(xiàn)配，具體劑量如下：

正常組及模型組：每天生理鹽水灌胃，劑量為1ml／100g／d；對照組：每天雷公藤多甙混懸液灌胃，劑量為1ml／100g／d；治療組：在對照組治療基礎(chǔ)上在大鼠神闕、腎腧、脾腧穴位上外敷腎敷靈。把腎敷靈做成約黃豆大小的藥丸貼于每個穴位，用巴布劑固定（治療前用電推剪剪除穴位處的鼠毛），每日1次，每次敷貼8～10小時。

1.4.5 標(biāo)本采集及處理實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)開始后2周、4周收集大鼠24小時尿液，用代謝籠收集24h尿液，用量杯搖勻取3ml，3000r／min離心5分鐘，去除沉渣，應(yīng)用全自動生化檢測儀動態(tài)檢測尿蛋白定量。

實(shí)驗(yàn)第28天結(jié)束時，取腎臟組織，處理后光鏡下觀察各組大鼠腎組織的病理改變；并用Western Blot法檢測NF-κB及TGF-β的表達(dá)。

1.4.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。全實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計量資料比較采用單因素的方差分析，P＜0.05或P＜0.01為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點(diǎn)24h尿蛋白水平見表1。

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)24小時尿蛋白定量分析結(jié)果

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)24小時尿蛋白定量分析結(jié)果

注：與正常組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0. 01；治療組與對照組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01

組別n 0天（mg／24h）14天（mg／24h）28天（mg／24h）正常組10 4.15±2.02 6.17±3.19 6.35±2.67模型組10 4.06±1.64 126.28±18.07▲▲278.87±25.68▲▲對照組10 4.18±1.78 66.53±12.48▲▲△△85.63±21.55▲▲△△治療組10 4.21±1.89 60.25±13.64▲▲△△56.37±24.64▲▲△△★★

根據(jù)上表，實(shí)驗(yàn)第14天、28天，模型組、對照組及治療組大鼠24h尿蛋白顯著高于正常組；與模型組相比，對照組及治療組24h尿蛋白量均顯著受到抑制（P＜0.01）；治療組24h尿蛋白量28天低于對照組（P＜0.01）。

2.2 光鏡下各組大鼠腎小球病理改變詳見圖1。

圖1 光鏡下各組大鼠腎小球病理改變

2.3 實(shí)驗(yàn)第28天各組NF-κB、TGF-β的Western Blot的蛋白變化見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)第28天各組NF-κB、TGF-β蛋白變化

表2 實(shí)驗(yàn)第28天各組NF-κB、TGF-β蛋白變化

注：與正常組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較△P＜0. 05，△△P＜0.01；治療組與對照組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01

組別n NF-κB TGF-β正常組10 0.18±0.02 0.19±0.03模型組10 0.79±0.06▲▲0.75±0.07▲▲對照組10 0.56±0.03▲▲△△0.40±0.03▲▲△△治療組10 0.31±0.04▲▲△△★★0.38±0.02▲▲△△

根據(jù)上表，實(shí)驗(yàn)第28天，與正常組相比，模型組、對照組、治療組大鼠腎組織中NF-κB、TGF-β的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，對照組及治療組明顯降低（P＜0.01）；其中NF-κB的水平治療組則明顯低于對照組（P＜0.01）。

3 討論

小兒難治性腎病病理類型多樣，以MeSPGN、FSGS、MCD多見［3-4］。通過國內(nèi)外文獻(xiàn)資料檢索，沒有發(fā)現(xiàn)其動物模型建立成功的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)典的腎病阿霉素腎病大鼠作為難治性腎病綜合征動物模型。實(shí)驗(yàn)第14天、28天，模型組、對照組及治療組大鼠24h尿蛋白顯著高于正常組，光鏡結(jié)果顯示：發(fā)現(xiàn)正常組大鼠腎小球系膜區(qū)無增生、沉積物，基底膜未見病變，毛細(xì)血管開放正常；模型組大鼠可見彌漫性腎小球系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)增生，毛細(xì)血管腔狹窄；雷公藤多甙組和腎敷靈合并雷公藤多甙組病變均不同程度減輕。通過對難治性腎病大鼠的蛋白尿及病理學(xué)研究，說明本次研究模型制作成功。

腎敷靈主要由黃芪、肉蓯蓉、川芎、仙茅、吳茱萸組成，借膏藥滲透和吸收，通過血脈、經(jīng)絡(luò)使藥力直達(dá)病所，以補(bǔ)先后天之本，健脾溫陽化濕、調(diào)和氣血，疏通經(jīng)絡(luò)，使諸虛得補(bǔ)，正氣得固，邪氣得除，使疾病向愈。而已知雷公藤多甙對難治性腎病具有皮質(zhì)激素樣的治療作用，但不存在激素的不良反應(yīng)，其療效值得肯定。

普遍認(rèn)為難治性腎病的發(fā)病與免疫功能紊亂相關(guān)，多種炎癥介質(zhì)參與腎病的病理生理過程且與臨床表現(xiàn)密切關(guān)聯(lián)。炎癥因子通過與細(xì)胞的相互作用，共同影響著腎臟疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸。核因子-KappaB（NF-κB）在各種因子相互影響和相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，起著中心調(diào)控作用。由于NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，被認(rèn)為是炎癥級聯(lián)反應(yīng)的中心靶點(diǎn)，其活性直接影響IL-6、TNF-a等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，而且其表達(dá)水平的變化先于其他炎性細(xì)胞的激活和炎癥因子的釋放。從而可見，NF-κB是早期炎癥的標(biāo)志性因子。趙潤民［5］等發(fā)現(xiàn)注射阿霉素后第7天，大鼠腎皮質(zhì)組織NF-κB活性開始升高，28d達(dá)高峰，明顯高于正常對照組（P＜0.01），阿霉素腎病大鼠腎皮質(zhì)中NF-κB DNA結(jié)合活性異常升高，CsA可通過抑制NF-κB活性減少尿蛋白排泄量。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）正常表達(dá)時，能夠抑制炎癥反應(yīng)，通過抑制細(xì)胞增殖而維持正常的細(xì)胞數(shù)量；過度表達(dá)時，參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成和分泌，抑制ECM的降解，還能誘導(dǎo)腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的聚集，是促進(jìn)腎纖維化的最重要的細(xì)胞因子之一。史偉［6］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在腎小球硬化腎炎各組中腎小球內(nèi)TGF-β1、Smad2、Smad3、FN的蛋白表達(dá)均明顯高于正常對照組，認(rèn)為TGF-β1及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smads蛋白可能參與了ECM在病變腎小球中的過量蓄積，從而在腎小球硬化過程中起重要作用。

本次研究結(jié)果提示腎敷靈外敷合并雷公藤多甙可以下調(diào)難治性腎病大鼠腎組織中的NF-κB及TGF-β的表達(dá)水平，從而減輕這兩種炎癥因子的表達(dá)，并且治療組降低NF-κB水平方面優(yōu)于TGF-β，提示其在腎臟病理改變早期即可阻斷炎癥因子，以減輕腎臟免疫性炎癥的改變，減少腎臟中系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞的損傷，保護(hù)大鼠腎小球和腎小管的功能，防止腎臟病理改變加重，以阻斷終末期病理改變的進(jìn)展。通過此次研究，可初步明確腎敷靈外敷合并雷公藤多甙在早期可下調(diào)炎癥因子的水平，阻斷朝腎纖維化的發(fā)展，這可能是其治療小兒難治性腎病的機(jī)制之一，值得臨床推廣應(yīng)用。

［1］楊霽云，白克敏.小兒腎臟病基礎(chǔ)與臨床［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：164.

［2］黃文彥，黃松明，甘衛(wèi)華，等.小兒難治性腎病病理特征的研究［J］.中國實(shí)用兒科雜志，1999，14（11）：681-682.

［3］畢丹青，畢丹艷，王彩瓊，等.難治性腎病綜合征48例病理臨床觀察［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2003，4（8）：462-463.

［4］沈輝君，劉愛民，戴宇文，等.難治性腎病綜合征患兒51例臨床與病理關(guān)系及預(yù)后分析［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2007，22（17）：1319-1320，1334.

［5］趙潤民，盧思廣，陳瑜，等.阿霉素腎病大鼠腎皮質(zhì)糖皮質(zhì)激素受體與核因子-κB活性的變化［J］.中國醫(yī)師雜志，2006，8（5）：588-591.

［6］史偉，何朝生，劉雙信，等.轉(zhuǎn)化生長因子131及Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎小球硬化中的作用［J］.中華腎臟病雜志，2005，21（5）：270-273.

Ef f e c t s o f Renal Tis s ue In flamma t o r y Fa c t o r NF-κB an d TGF-βon t h e Tr ea tme n t o f Re f r a c t o r y Ne p h r o tic Rat b y Ex t e r nal Usin g She n f ulin g Combin e d wit h Trip te r y giu m Gl y c osid e s

Zhang Xuerong,LiYunhai
(Synopsis of the Golden Chamber,Hubei University of TCM,Wuhan,Hubei Province,430061,China)

ObjectiveTo observe the effects of renal tissue inflammatorx factor NF-κBand TGF-βon the treatment of refractorx nephrotic rat bx ewternal used Shenfuling combined vith tripterxgium glxcosides in this ewperiment.Methods4 groups vere randomlx divided into normal group，model group，control group，treatment group.The rats in the model group，control group，treatment group

adriamxcin 6.0mg／kg a single intravenous injection and gastric perfusion in the seventh dax of the ewperiment，normal group，model group vas gavaged vith normal saline dailx；the control group vere gavaged tripterxgium glxcosides suspension dailx；on the basis of the control group treatment the treatment group received ewternal used Shenfuling on the point for ewample Shenque，Shenshu，Pishu acupoint.Before the ewperiment，2 veeks and 4 veeks after the ewperiment 24 hours urine of rats vere collected to detect 24 urinarx protein；after the ewperiment NF-κB，TGF-βlevel in the renal tissue vere detected bx Western Blot method.Results14 dax，28 dax，24h urine protein of rats in the model group，control group and treatment group vas significantlx higher than that in normal group；compared vith the model group，24h urinarx protein in the treatment group and control group vere significantlx inhibited（P＜0.01）；24h urinarx protein 28 daxs in treatment group vas less than that in control group（P＜0.01）；28 dax of the ewperiment，the ewpression of NF-κB，TGF-βin the rat renal tissue of the model group，control group and treatment group vas significantlx up-regulated compared vith the normal group（P＜0.01）；compared vith the model group，control group and treatment group decreased significantlx（P＜0.01）；the NF-κB levels in treatment group vas significantlx lover than that of the control group（P＜0.01）.ConclusionEwternal used Shenfuling combined vith tripterxgium glxcosides can inhibit the ewpression of NF-κB and TGF-β，reduce the inflammation of refractorx glomerular nephropathx rats，inhibit glomerular injurx.

Refractorx nephrotic sxndrome；Shenfuling；NF-κB；TGF-β；Ewternal treatment of traditional Chinese Medicine

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.02.103

：1672-2779（2014）-02-0152-03

??張文娟 本文校對：李云海

2013-10-12）