鹿 茸，田 琴，孫 楠，喬治軍，張麗珍,*，牛 偉，單 璐，冀佩雙

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山西 太原 030006；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西 太原 030006）

糜子（PanicummiliaceumL.）屬禾本科（Gramineae）黍?qū)伲≒anicum L.），又稱黍、稷和穄，屬特色小雜糧[1]。起源于中國(guó)黃河流域的 黃土高原地區(qū)，具有耐鹽堿、耐冷、耐旱、耐貧瘠的特點(diǎn)，是干旱、半干旱地區(qū)主要的糧食作物，也是我國(guó)主要的制米作物[2]。糜子果實(shí)為穎果，脫殼后稱為糜米。隨著人民生活水平不斷提高，業(yè)界對(duì)全谷物食品關(guān)注度增加，作物品質(zhì)越來(lái)越受到人們關(guān)注，小雜糧的育種栽培及功能成分的研究也得以快速發(fā)展。流行病學(xué)研究表明增加糜子及其加工產(chǎn)品的攝入量可以降低一些慢性病的風(fēng)險(xiǎn)，如血液中膽固醇[3]、心血管疾病[4]、Ⅱ型糖尿病[5]和肝損傷[6]。因此進(jìn)一步探明糜子中對(duì)健康起促進(jìn)作用的物質(zhì)有著重要的意義。

植物多酚是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個(gè)酚羥基的植物成分的總稱[7-8]，其苯環(huán)上的羥基極易失去電子，可以作為良好的電子供體，具有抗氧化功能。植物多酚廣泛存在于植物的皮、根、葉和果實(shí)中，其含量?jī)H次于纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素[9]。近年來(lái)植物多酚的研究成為植物代謝產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)之一，但有關(guān)的研究多集中在水果[10-12]、蔬菜以及茶葉中[13]。研究發(fā)現(xiàn)谷物中含有多種酚酸類物質(zhì)[14]，如阿魏酸[8,15-18]、香豆酸[19]等。谷物中酚酸類物質(zhì)的種類與含量和果蔬相當(dāng)[7-8,20]，某些活性物質(zhì)含量甚至要高于果蔬。張莉等[21]研究表明添加麩皮生成的食醋中的總多酚和總抗氧化能力均優(yōu)于未添加麩皮的食醋。臧盛等[22]發(fā)現(xiàn)不同品種糜子間多酚含量差異較大。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)糜子麩皮和糜米中的多酚物質(zhì)，采用高效液相色譜法分析其酚酸成分和含量，為拓寬糜子麩皮的利用價(jià)值及其為麩皮用于天然抗氧化劑的開發(fā)提供依據(jù)，為培育與選用高生理活性物質(zhì)含量的糜米谷物食品加工原料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糜子樣品（赤黍2號(hào)、粘豐7號(hào)、齊黍1號(hào)、粘豐5號(hào)、白糜子、黃糜子、赤糜2號(hào)）均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所提供，樣品保存于該所的作物種質(zhì)資源中期貯存庫(kù)，2012年產(chǎn)于山西。

沒(méi)食子酸（批號(hào)：SLBC5726V，純度≥98.5%）、綠原酸（批號(hào)：SLBD3109V，純度≥95%）、丁香酸（批號(hào)：BCBB6440V，純度≥95%）、香草酸（批號(hào)：BCBF7869V，純度≥97.0%，色譜純）、p-香豆酸（批號(hào)：91M1197V，純度≥98.0%，色譜純）、阿魏酸（批號(hào)：STBB8393V，純度≥99%，色譜純） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；福林-酚 北京索萊寶科技有限公司；乙腈（色譜純） 天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；95%乙醇 河北中泰藥械有限公司；Na2CO3天津鵬達(dá)化學(xué)試劑有限公司；三氟酸（分析純） 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

JLGJ-45型檢驗(yàn)礱谷機(jī) 浙江臺(tái)州市糧儀廠；Cyclotec 1093型旋風(fēng)式樣品磨 丹麥FOSS公司；DHG-9040S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 寧波東南儀器有限公司；BS223S電子天平 德國(guó)Sartorius公司；2-16PK高速冷凍離心機(jī) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海嘉鵬科技有限公司；752PC型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；1200型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 原料的預(yù)處理

將糜子樣品用檢驗(yàn)礱谷機(jī)脫殼后，分別將糜子的麩皮和糜米粉碎成粉末狀，分裝，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 含水量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取各糜子樣品的麩皮及糜米m1，用錫箔紙包好后放在烘箱內(nèi)，于110 ℃烘干72 h，取出后稱得烘干后樣品質(zhì)量m2，按式（1）計(jì)算樣品含水量：

式中：m1為樣品的初始質(zhì)量/g；m2為樣品烘干后的質(zhì)量/g。

1.3.3 自由酚的提取

將糜子麩皮（或糜米）與95%乙醇溶液按1∶30或1∶15（g/mL）的比例混勻，充分振蕩混合提取5 min后，2 500 r/min離心10 min，收集上清液，重復(fù)3 次，合并上清液，于75 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，用去離子水定容至5 mL，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，分裝，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 總酚含量的測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)液的制備

準(zhǔn)確稱取沒(méi)食子酸25 mg溶于25 mL去離子水中，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液的母液。將母液稀釋至系列質(zhì)量濃度為0、20、60、100、150、200、300、400、500、600 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，避光保存。

1.3.4.2 總酚含量的測(cè)定

采用福林-酚法測(cè)定總酚含量[23]。在玻璃培養(yǎng)管中加入100 μL樣品液（或標(biāo)準(zhǔn)溶液）、400 μL去離子水和100 μL福林-酚試劑，充分混勻，反應(yīng)6 min。再加入1 mL 7 g/100 mL的Na2CO3溶液和0.8 mL去離子水，充分混勻，室溫條件下避光靜置90 min。在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。多酚含量以每100 g樣品干質(zhì)量中對(duì)應(yīng)的沒(méi)食子酸的質(zhì)量表示（mg沒(méi)食子酸/100 g樣品）。

1.3.5 高效液相色譜檢測(cè)樣品中多酚的成分和含量

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流動(dòng)相為乙腈-水（2∶8，V/V，pH 3.0）。

1.3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

準(zhǔn)確稱取酚酸標(biāo)準(zhǔn)品各30 mg溶于少量流動(dòng)相中，溶解后移至100 mL容量瓶，用流動(dòng)相定容至100 mL，得到酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的母液。將標(biāo)準(zhǔn)母液稀釋至系列質(zhì)量濃度，以備檢測(cè)各酚酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.3 色譜峰分離度的計(jì)算

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合進(jìn)樣，按1.3.5.1節(jié)色譜條件分析，按式（2）計(jì)算色譜峰分離度R：

式中：t1為色譜峰1的保留時(shí)間/min；t2為色譜峰2的保留時(shí)間/min；y1為色譜峰1的峰寬；y2為色譜峰2的峰寬。R＞1.5即為完全分離。

1.3.5.4 加標(biāo)回收率

將酚酸標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至一定質(zhì)量濃度，取100 μL，再加入100 μL待測(cè)樣品液，充分混勻后檢測(cè)加標(biāo)回收率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上實(shí)驗(yàn)每份樣品做3次重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Excel 2010分析數(shù)據(jù)并繪制柱狀圖；使用SPSS 19.0進(jìn)行方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品含水量

表 1 不同品種糜子的含水量Table 1 Water contents in different varieties of proso millet%

如表1所示，糜子麩皮的含水量為7.33%～8.29%，糜米的含水量為10.19%～11.35%，糜子麩皮中水分含量少于糜米，且品種間差異顯著（P＜0.05）。

2.2 總酚含量的測(cè)定

2.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用福林-酚法繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.002 2X＋0.021 7，R2=0.998 7，可以用于測(cè)定酚酸含量。

2.2.2 樣品中自由態(tài)酚酸含量

圖 1 不同品種糜子的自由酚含量Fig.1 Free phenol contents in different varieties of proso millet

由圖1和表2可知，糜子麩皮中自由酚含量為114.57～159.22 mg沒(méi)食子酸/100 g樣品，不同品種糜子麩皮之間自由酚含量沒(méi)有顯著性差異。糜米中自由酚含量為26.84～47.98 mg沒(méi)食子酸/100 g樣品，不同品種糜子糜米之間自由酚含量差異極其顯著（P＜0.01）。赤糜2號(hào)麩皮和糜米自由酚含量最高，麩皮159.22 mg沒(méi)食子酸/100 g樣品，糜米47.98 mg沒(méi)食子酸/100 g樣品。粘豐7號(hào)麩皮和糜米之間自由酚含量差異顯著（P＜0.05），其他品種同一品種間麩皮和糜米的自由酚含量差異極其顯著（P＜0.01），糜子麩皮自由酚含量遠(yuǎn)高于糜米。

表 2 不同品種糜子的自由酚含量Table 2 Free phenol contents in different varieties of proso millet mg沒(méi)食子酸/100 g樣品

2.3 高效液相色譜法分析樣品多酚提取物

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合進(jìn)樣，按1.3.5.1節(jié)色譜條件分析，綠原酸與丁香酸之間分離度為20.90，丁香酸與香草酸之間分離度為2.59，香草酸與p-香豆酸之間分離度為22.11，p-香豆酸與阿魏酸之間分離度為10.69。綠原酸、丁香酸、香草酸、p-香豆酸、阿魏酸均能良好分離（圖2）。

圖 2 混合酚酸類標(biāo)準(zhǔn)溶液分離色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed pheolic acid standards

2.3.2 高效液相色譜加標(biāo)回收率

表 3 加標(biāo)回收率Table 3 Spike recoveries of 5 pheolic acids

由表3可知，5種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的加標(biāo)回收率為93.2%～104.1%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度較高。

2.3.3 高效液相色譜法測(cè)定糜子樣品多酚含量

由表4可知，糜子中酚酸類物質(zhì)有綠原酸、丁香酸、香草酸、p-香豆酸、阿魏酸，種類豐富。麩皮和糜米中均含有丁香酸和p-香豆酸，其含量分別為丁香酸0.85～1.63 mg/100 g樣品（麩皮）、丁香酸0.39～1.00 mg/100 g樣品（糜米）、p-香豆酸1.33～2.06 mg/100 g樣品（麩皮）、p-香豆酸0.57～0.84 mg/100 g樣品（糜米）。白糜子、黃糜子、赤糜2號(hào)麩皮中均含有以上5種酚酸，其中綠原酸含量較高，分別為：白糜子2.94 mg/100 g樣品、黃糜子6.89 mg/100 g樣品、赤糜2號(hào)8.05 mg/100 g樣品。不同品種的糜子中酚酸類物質(zhì)成分和含量均不相同，相同品種麩皮和糜米中酚酸的種類和含量差別明顯。

表 4 樣品中酚酸類成分及含量Table 4 Phenolic acids identified in different varieties of proso millet expressed as mg per 100 g sample mg/100 g樣品

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了糜子麩皮和糜米中自由酚含量的差別，并利用高效液相色譜對(duì)糜子中酚酸類物質(zhì)的種類和含量進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，不同品種糜子麩皮之間自由酚含量差異不顯著，不同品種糜子糜米之間自由酚含量差異極其顯著（P＜0.01）。赤糜2號(hào)麩皮和糜米中自由酚含量最高，麩皮中159.22 mg沒(méi)食子酸/100 g樣品；糜米中47.98 mg沒(méi)食子酸/100 g樣品。比徐元元等[24]報(bào)道的糜子自由酚含量高，可能是由于糜子品種不同?？梢姴煌贩N糜子多酚含量存在差異，有些品種的抗氧化潛力有待發(fā)掘，日后應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化多酚的提取工藝。粘豐7號(hào)麩皮和糜米之間自由酚含量差異顯著（P＜0.05），其他品種同一品種間麩皮和糜米自由酚含量差異極其顯著（P＜0.01），糜子麩皮自由酚含量遠(yuǎn)高于糜米。這與汪海波等[25]對(duì)燕麥中抗氧化成分的研究結(jié)果相似（燕麥麩皮抗氧化成分高于胚乳）。

5種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的加標(biāo)回收率為93.2%～104.1%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度較高。糜子中酚酸類物質(zhì)有綠原酸、丁香酸、香草酸、p-香豆酸、阿魏酸，種類豐富。麩皮和糜米中均含有丁香酸和p-香豆酸，白糜子、黃糜子、赤糜2號(hào)麩皮中均含有綠原酸。不同品種糜子的酚酸類物質(zhì)種類和含量不盡相同，相同品種糜子麩皮和糜米中酚酸類物質(zhì)種類和含量差別明顯。結(jié)果表明，糜子麩皮中酚酸類物質(zhì)含量豐富，有較高的利用價(jià)值，但在生產(chǎn)中往往都被廢棄，今后需要對(duì)糜子中酚酸類物質(zhì)提取工藝和作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，以期為生產(chǎn)實(shí)踐提供依據(jù)。

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