芮露明，彭增起*，汪 敏，張 露，姚 瑤，王復(fù)龍，張雅瑋，惠 騰，李君珂

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

甲醛是一種高毒性物質(zhì)，具有致癌、致畸性。相關(guān)研究表明，甲醛對人體免疫系統(tǒng)和呼吸道均有較大影響，長期接觸低劑量甲醛會引起慢性呼吸道疾病、鼻咽癌、腦瘤、結(jié)腸癌等，還會導(dǎo)致新生兒染色體異常、白血病，以及引起青少年記憶力和智力的下降等嚴重后果[1-3]。此外，甲醛的基因遺傳毒性已在人工培養(yǎng)的哺乳動物細胞的體內(nèi)實驗與動物實驗被證實[4-6]。美國環(huán)境保護署鑒于其危害性確立了甲醛的參考劑量為0.2 mg/（kg·d），當(dāng)暴露量逐漸大于參考劑量時，會增加對健康造成不利影響的風(fēng)險[7]。

甲醛作為一種很多生物可以產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物，卻在許多食品如香菇中出現(xiàn)，且甲醛含40～380 mg/kg不等。而在食品保藏中人工甲醛的非法使用導(dǎo)致了甲醛的嚴重超標(biāo)，極大地損害了人們的身體健康。在福州、大連、廣州、武漢、上海等地的一些獨立研究發(fā)現(xiàn)，一些采用甲醛非法處理來進行保藏的海產(chǎn)品，甲醛含量超過300 mg/kg，更有甚者達到4 250 mg/kg[8-10]。而熏肉制品表面也會含有大量甲醛[11-12]，這主要是木材在缺氧狀態(tài)下干餾所得，吸附聚集在產(chǎn)品的表面。甲醛具有一定的抗菌作用，可在一定程度上防止熏肉腐敗，與此同時也給煙熏肉制品帶來的極 大的安全隱患。

關(guān)于水產(chǎn)品、香菇及啤酒等食品中 的甲醛檢測方法已有報道[13-16]，而作為中國傳統(tǒng)特色的煙熏臘肉中甲醛測定的研究幾乎沒有，且在肉制品中也缺乏關(guān)于甲醛限量的標(biāo)準，所以有必要建立一種快捷、高效、準確的方法，來測定煙熏肉制品，尤其是煙熏臘肉中甲醛含量，為標(biāo)準的建立提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熏肉、熏腸購自湖南益陽市安化縣以及重慶涪陵區(qū)當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

2,4-二硝基苯肼溶液（1 g/L）：稱取0.1 g 2,4-二硝基苯肼溶解于24 mL濃鹽酸中，加水定容至100 mL，過濾離心備用；緩沖溶液（pH 5）：稱取2.64 g乙酸鈉，以適量水溶解，加入1.0 mL冰乙酸，用水定容至500 mL，用pH計測定其pH值，必要時進行酸堿調(diào)節(jié)；甲醛標(biāo)準溶液（純度＞99%）：100 mg/L；二氯甲烷和甲醇均為色譜級；磷酸（濃磷酸與水按體積比1∶9配制）。

1.2 儀器與設(shè)備

旋渦混合器、LFS-15流量計、320-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 德國Brüker公司；HY-04B粉碎機 北京環(huán)亞天元機械有限公司；AL104電子天平 梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；T25分散機 德國IKA公司；臺式超速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；水蒸氣蒸餾裝置。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準曲線的繪制

移取10、20、5 0 、70、100 μL甲醛溶液（100 mg/L）置于5 mL具塞比色管中，分別加入0.30 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，置60 ℃水浴30 min，然后在流水中快速冷卻，加入2 mL二氯甲烷，用旋渦混合器振蕩萃取1 min，4 000 r/min離心5 min使溶液分層，取上清液再用1 mL二氯甲烷萃取1 次，合并2 次萃取的下層黃色溶液，將萃取液經(jīng)無水硫酸鈉柱脫水，60 ℃水浴蒸干，冷卻。取1.0 mL甲醇溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機分析。制作甲醛標(biāo)準曲線，確定標(biāo)準曲線范圍。

1.3.2 熏肉樣品的前處理

采用水蒸氣蒸餾法進行前處理，具體參照朱易等[17]的方法并稍作修改。

1.3.3 樣品衍生化與萃取

取蒸餾液1.0 mL，置于5 mL具塞比色管中，分別加入0.30 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，置60 ℃水浴30 min，然后在流水中快速冷卻，加入2 mL二氯甲烷，用旋渦混合器振蕩萃取1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液再用1 mL二氯甲烷萃取1 次，合并2 次萃取的下層黃色溶液，將萃取液經(jīng)無水硫酸鈉柱脫水，60 ℃水浴蒸干，冷卻。取1.0 mL色譜純甲醇溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后作分析用。

1.3.4 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

1.3.4.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-5彈性石英毛細管柱；柱溫60 ℃；進樣口溫度260 ℃；程序升溫：以10 ℃/min升溫速度升至150 ℃，然后升溫至260 ℃，恒溫5 min；載氣He；柱前壓40 kPa；分流比10∶1；溶劑延遲5 min；進樣量1 μL。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；電子倍增器電壓1.02 kV；接口溫度250 ℃；選擇離子檢測m/z 79、210。

1.3.5 加標(biāo)回收率

取3 種不同肉樣（本底不含甲醛）粉碎，準確稱取2.0 g，分別加入10、20、30 mg/kg不同含量的甲醛，按實驗方法衍生、萃取、上機檢測，根據(jù)標(biāo)準曲線計算樣品以及不同加標(biāo)水平下的甲醛提取量。

1.3.6 重復(fù)性實驗

在臘肉樣品中（本底不含有甲醛）加入相當(dāng)于樣品5 mg/kg的甲醛標(biāo)準溶液，樣本量為6，按實驗方法前處理、衍生、萃取、上機測定，考察方法的精密度。

1.3.7 檢出限

方法的檢出限定義為產(chǎn)生3倍信噪比（RSN=3）的化合物的質(zhì)量濃度，選取空白肉樣（本底不含甲醛），樣本量n=6，分別加入10 μL的甲醛標(biāo)準溶液，然后進行衍生、萃取、上機檢測，得出檢出限。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準偏差表示，用M icrosoft Excel統(tǒng)計處理，用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行線性分析和鄧肯多重比較，P＜0.05表示 差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生反應(yīng)

醛類物質(zhì)可在酸性介質(zhì)中與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)形成較穩(wěn)定的希夫堿， 本實驗中生成的2,4-二硝基苯腙，反應(yīng)式如下：

衍生劑用量和酸性是影響衍生反應(yīng)的重要因素。適量的酸有助于促進甲醛與2,4-二硝基苯肼的反應(yīng)[18-19]，然而過多的酸將會損壞毛細管柱。稱取0.1 g 2,4-二硝基苯肼溶解于24 mL濃鹽酸中，加水定容至100 mL。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件的確定

2.2.1 色譜柱的選擇

選用DB-5彈性石英毛細管柱，因其較好的惰性與柔性，吸附和催化性較小，適于目標(biāo)化合物的分析。

2.2.2 柱溫的選擇

預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)選擇210 ℃恒溫時，衍生物的出峰時間較早，峰形矮胖且分岔，檢測靈敏度不高。當(dāng)采用程序升溫，以10 ℃/min升溫速度升至150 ℃，然后升溫至260 ℃，恒溫5 min。出峰時間在18 min左 右，峰形與重復(fù)性較好，靈敏度也較高。

2.2.3 測定方法與特征離子的選擇

由于煙熏臘肉基體復(fù)雜，用高效液相色譜或氣相色譜法測定基質(zhì)干擾較大，結(jié)果往往偏高。通常需層析柱再進行洗脫凈化，操作繁瑣?；厥章时容^低。故選用氣相色譜-質(zhì)譜選擇離子檢測，這樣可消除雜質(zhì)對檢測的干擾，選擇性明顯提高。靈敏度比全掃描模式提高兩個數(shù)量級。衍生產(chǎn)物2,4-二硝基苯腙的質(zhì)譜圖見圖1。2,4-二硝基苯腙的碎片離子豐度中最大的峰為m/z 63，其次為m/z 79，且兩者差距不大，分子離子峰為m/z 210。根據(jù)選擇離子的原則，應(yīng)盡量選擇質(zhì)荷比較大的特征離子，以提高準確度；同時選擇豐度較大的離子，以提高檢測的靈敏度。如圖2所示，選擇離子掃描可很好地排除雜質(zhì)峰的干擾。綜上考慮，選擇m/z 79和m/z 210為參考檢測離子，以消除雜質(zhì)峰的干擾影響，保證檢測的準確性與靈敏度。

圖 1 2,4-二硝基苯腙的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of 2,4-dinitrobenzene formaldehyde hydrazone

圖 2 總離子流和特征離子色譜圖Fig.2 Total ion current and selected ion chromatograms

2.3 衍生化與萃取處理條件優(yōu)化（甲醛標(biāo)液添加量均為50 μL）

2.3.1 衍生劑用量

圖 3 峰面積隨衍生試劑用量變化的曲線Fig.3 Peak area vs. derivatization agent dosage

理論上，任何能與羰基反應(yīng)的大分子有機物質(zhì)都可以作為本實驗的衍生化試劑。綜合篩選，本實驗選用2,4-二硝基苯肼做為衍生劑，其主要特點是相對分子質(zhì)量適中，在常溫條件下反應(yīng)完全、快速。由圖3可知，衍生產(chǎn)物的峰面積隨著衍生化試劑用量的增加，在0.3 mL之前呈上升的趨勢，0.3 mL之后呈下降的趨勢，幅度較小。在用量0.3 mL處，峰面積最大，所以50 μL甲醛添加量的最佳衍生劑用量為0.3 mL。

2.3.2 衍生化時間

由圖4可見，隨著衍生化時間的延長，2,4-二硝基苯腙產(chǎn)物的峰面積增大，但并非呈一直增加的趨勢。當(dāng)衍生化時間在30 min以內(nèi)時，峰面積的響應(yīng)值隨時間的延長而增加，而隨后又下降，在30 min處達最高值。所以，衍生化時間選擇30 min。

圖 4 峰面積隨衍生化時間變化的曲線Fig.4 Peak area vs. derivatization time

2.3.3 衍生化溫度

圖 5 峰面積隨衍生化溫度變化的曲線Fig.5 Peak area vs. derivatization temperature

由圖5可見，隨著衍生化溫度的升高，2,4-二硝基苯腙產(chǎn)物的峰面積增大，但并非是一直增大，當(dāng)衍生化溫度在60 ℃以內(nèi)時，峰面積的響應(yīng)值隨溫度的升高而增加，而隨后又下降，在60 ℃條件下達最高值。所以，衍生化溫度選擇60 ℃。對于更準確具體的最適衍生溫度，可以進行進一步的探索。

2.3.4 萃取次數(shù)

二氯甲烷的用量和萃取的次數(shù)直接影響衍生物萃取率，從而間接影響測定的結(jié)果。實驗中第1次萃取用2 mL，隨后的每次用量為1 mL。如圖6顯示，2 次萃取后，萃取基本完全。盡管二氯甲烷是色譜級，但過多的萃取劑二氯甲烷仍會多帶入一些雜質(zhì)，從而影響結(jié)果的準確性。所以，從檢測準確性與成本考慮選擇二氯甲烷萃取，第1次萃取用2 mL，隨后的每次用量為1 mL，萃取2 次。

圖 6 峰面積隨萃取次數(shù)變化的曲線Fig.6 Peak area vs. extraction number

2.4 甲醛質(zhì)量濃度標(biāo)準曲線

按照1.3.1節(jié)方法，以甲醛質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線，得回歸方程為y=22 974.8x－0.194 63，R2=0.999 7，在甲醛反應(yīng)液質(zhì)量濃度為0.1～15 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 驗證實驗

2.5.1 加標(biāo)回收率

在臘肉樣品中（本底不含有甲醛）分別加入相當(dāng)于樣品質(zhì)量分數(shù)分別為0.5、1.5、5 mg/kg的甲醛標(biāo)樣進行測定，計算出回收率結(jié)果見表1。

表 1 臘肉制品中甲醛加標(biāo)回收率Table 1 Recoveries and precision (RSD) for formaldehyde standard added to smoked meat

2.5.2 重復(fù)性實驗

按照1.3.6節(jié)方法處理，重復(fù)6 次實驗，得到相對標(biāo)準偏差為2.89%。表明本法具體很好的重復(fù)性。

2.5.3 檢出限

按上述分析方法，在不含甲醛的樣品本底中添加一定量的甲醛標(biāo)準進行實驗，最低檢測質(zhì)量濃度0.01 mg/L，以取樣量2.0 g計，本法對樣品的檢出限為0.50 mg/kg。

2.6 甲醛含量的測定

從重慶與湖南購買4 個品牌的臘肉，每個品牌購買3 袋，按照1.3.2、1.3.3節(jié)的方法進行前處理衍生化，按照1.3.4節(jié)的色譜條件進行測定，每個樣品取表層（表面0.5 cm厚）與內(nèi)部各3 份，每份平行測定3 次，取平均值，所測樣品中甲醛的含量結(jié)果見表2。利用所建立的方法對市售臘肉中甲醛含量進行了分析，4 種臘肉表層與內(nèi)部均存在著一定量的甲醛。從表2可以看出，所檢測的熏肉制品中甲醛含量均較高，最高甚至達到了254.52 mg/kg。煙熏臘肉表層甲醛含量要大于內(nèi)部。

表 2 不同樣品臘肉甲醛的含量Table 2 Formaldehyde contents of different smoked meats mg/kg

3 討 論

現(xiàn)在關(guān)于食品中甲醛的測定的研究主要集中在啤酒、蘑菇、海產(chǎn)品等樣品，李軍[20]、王宏華[21]等對啤酒中甲醛含量的測定進行研究，鄭斌[22]、迂君[23]等對水產(chǎn)品、海產(chǎn)品中甲醛測定開展相應(yīng)研究，還有研究者用衍生-液相色譜法檢測香菇中的甲醛含量。而熏肉制品中的甲醛檢測方法卻鮮有報道。熏肉制品由于質(zhì)地較干硬、存在著脂肪與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾，使得甲醛的提取存在著一定的困難。

在酸性環(huán)境中，甲醛極易揮發(fā)出來，影響測定結(jié)果，水蒸氣蒸餾可以很好解決這一問題。本實驗在傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾裝置的基礎(chǔ)上進行了改進，將原來的圓底燒瓶換成了半微量的定氮整流器，有效地降低了樣品量，從而提高回收率。實驗對衍生化以及萃取處理的條件進行了優(yōu)化，具體有衍生劑用量、衍生化時間、衍生化溫度、萃取次數(shù)4 個因素，這些因素直接影響的檢測的結(jié)果。

衍生劑用量過少，衍生化不充分，過多，因為衍生劑本身的純度則會給樣品帶來新的雜質(zhì)，而衍化時間過長衍生溫度過高，則會影響衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性。混合液萃取2 次以后，峰面積增加不顯著。結(jié)合實驗結(jié)果，選擇加入0.3 mL 2,4-二硝基苯肼、衍生化溫度60 ℃、衍生化時間30 min、用二氯甲烷進行萃取、萃取2 次。

目前在甲醛檢測方法的研究中，各研究者所研究的研究對象各不相同，再加上儀器設(shè)備條件參差不齊，因此每個方法各有側(cè)重點，也各有優(yōu)劣。與其他甲醛檢測的方法相比，本方法色譜條件更為簡單，前處理對樣品本身的物理特性依賴性小。從方法學(xué)評價結(jié)果來看，樣品的干擾基質(zhì)少，具有較低的檢測限以及較好的回收率和精密度，能夠滿足檢測的要求。

實際樣品中甲醛含量的測定結(jié)果表明有些煙熏臘肉的甲醛含量令人堪憂，如何在保留傳統(tǒng)煙熏肉制品獨特風(fēng)味的基礎(chǔ)上降低或消除甲醛的安全風(fēng)險，已成為對傳統(tǒng)煙熏肉制品發(fā)展的一個挑戰(zhàn)。

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