芮露明,彭增起*,汪 敏,張 露,姚 瑤,王復(fù)龍,張雅瑋,惠 騰,李君珂
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)
甲醛是一種高毒性物質(zhì),具有致癌、致畸性。相關(guān)研究表明,甲醛對人體免疫系統(tǒng)和呼吸道均有較大影響,長期接觸低劑量甲醛會引起慢性呼吸道疾病、鼻咽癌、腦瘤、結(jié)腸癌等,還會導(dǎo)致新生兒染色體異常、白血病,以及引起青少年記憶力和智力的下降等嚴重后果[1-3]。此外,甲醛的基因遺傳毒性已在人工培養(yǎng)的哺乳動物細胞的體內(nèi)實驗與動物實驗被證實[4-6]。美國環(huán)境保護署鑒于其危害性確立了甲醛的參考劑量為0.2 mg/(kg·d),當(dāng)暴露量逐漸大于參考劑量時,會增加對健康造成不利影響的風(fēng)險[7]。
甲醛作為一種很多生物可以產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物,卻在許多食品如香菇中出現(xiàn),且甲醛含40~380 mg/kg不等。而在食品保藏中人工甲醛的非法使用導(dǎo)致了甲醛的嚴重超標(biāo),極大地損害了人們的身體健康。在福州、大連、廣州、武漢、上海等地的一些獨立研究發(fā)現(xiàn),一些采用甲醛非法處理來進行保藏的海產(chǎn)品,甲醛含量超過300 mg/kg,更有甚者達到4 250 mg/kg[8-10]。而熏肉制品表面也會含有大量甲醛[11-12],這主要是木材在缺氧狀態(tài)下干餾所得,吸附聚集在產(chǎn)品的表面。甲醛具有一定的抗菌作用,可在一定程度上防止熏肉腐敗,與此同時也給煙熏肉制品帶來的極 大的安全隱患。
關(guān)于水產(chǎn)品、香菇及啤酒等食品中 的甲醛檢測方法已有報道[13-16],而作為中國傳統(tǒng)特色的煙熏臘肉中甲醛測定的研究幾乎沒有,且在肉制品中也缺乏關(guān)于甲醛限量的標(biāo)準,所以有必要建立一種快捷、高效、準確的方法,來測定煙熏肉制品,尤其是煙熏臘肉中甲醛含量,為標(biāo)準的建立提供一定的參考。
熏肉、熏腸購自湖南益陽市安化縣以及重慶涪陵區(qū)當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。
2,4-二硝基苯肼溶液(1 g/L):稱取0.1 g 2,4-二硝基苯肼溶解于24 mL濃鹽酸中,加水定容至100 mL,過濾離心備用;緩沖溶液(pH 5):稱取2.64 g乙酸鈉,以適量水溶解,加入1.0 mL冰乙酸,用水定容至500 mL,用pH計測定其pH值,必要時進行酸堿調(diào)節(jié);甲醛標(biāo)準溶液(純度>99%):100 mg/L;二氯甲烷和甲醇均為色譜級;磷酸(濃磷酸與水按體積比1∶9配制)。
旋渦混合器、LFS-15流量計、320-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 德國Brüker公司;HY-04B粉碎機 北京環(huán)亞天元機械有限公司;AL104電子天平 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;T25分散機 德國IKA公司;臺式超速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;水蒸氣蒸餾裝置。
1.3.1 標(biāo)準曲線的繪制
移取10、20、5 0 、70、100 μL甲醛溶液(100 mg/L)置于5 mL具塞比色管中,分別加入0.30 mL 2,4-二硝基苯肼溶液,置60 ℃水浴30 min,然后在流水中快速冷卻,加入2 mL二氯甲烷,用旋渦混合器振蕩萃取1 min,4 000 r/min離心5 min使溶液分層,取上清液再用1 mL二氯甲烷萃取1 次,合并2 次萃取的下層黃色溶液,將萃取液經(jīng)無水硫酸鈉柱脫水,60 ℃水浴蒸干,冷卻。取1.0 mL甲醇溶解殘渣,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機分析。制作甲醛標(biāo)準曲線,確定標(biāo)準曲線范圍。
1.3.2 熏肉樣品的前處理
采用水蒸氣蒸餾法進行前處理,具體參照朱易等[17]的方法并稍作修改。
1.3.3 樣品衍生化與萃取
取蒸餾液1.0 mL,置于5 mL具塞比色管中,分別加入0.30 mL 2,4-二硝基苯肼溶液,置60 ℃水浴30 min,然后在流水中快速冷卻,加入2 mL二氯甲烷,用旋渦混合器振蕩萃取1 min,4 000 r/min離心5 min,取上清液再用1 mL二氯甲烷萃取1 次,合并2 次萃取的下層黃色溶液,將萃取液經(jīng)無水硫酸鈉柱脫水,60 ℃水浴蒸干,冷卻。取1.0 mL色譜純甲醇溶解殘渣,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后作分析用。
1.3.4 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件
1.3.4.1 氣相色譜條件
色譜柱:DB-5彈性石英毛細管柱;柱溫60 ℃;進樣口溫度260 ℃;程序升溫:以10 ℃/min升溫速度升至150 ℃,然后升溫至260 ℃,恒溫5 min;載氣He;柱前壓40 kPa;分流比10∶1;溶劑延遲5 min;進樣量1 μL。
1.3.4.2 質(zhì)譜條件
電子電離源;電子能量70 eV;四極桿溫度150 ℃;離子源溫度230 ℃;電子倍增器電壓1.02 kV;接口溫度250 ℃;選擇離子檢測m/z 79、210。
1.3.5 加標(biāo)回收率
取3 種不同肉樣(本底不含甲醛)粉碎,準確稱取2.0 g,分別加入10、20、30 mg/kg不同含量的甲醛,按實驗方法衍生、萃取、上機檢測,根據(jù)標(biāo)準曲線計算樣品以及不同加標(biāo)水平下的甲醛提取量。
1.3.6 重復(fù)性實驗
在臘肉樣品中(本底不含有甲醛)加入相當(dāng)于樣品5 mg/kg的甲醛標(biāo)準溶液,樣本量為6,按實驗方法前處理、衍生、萃取、上機測定,考察方法的精密度。
1.3.7 檢出限
方法的檢出限定義為產(chǎn)生3倍信噪比(RSN=3)的化合物的質(zhì)量濃度,選取空白肉樣(本底不含甲醛),樣本量n=6,分別加入10 μL的甲醛標(biāo)準溶液,然后進行衍生、萃取、上機檢測,得出檢出限。
數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準偏差表示,用M icrosoft Excel統(tǒng)計處理,用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行線性分析和鄧肯多重比較,P<0.05表示 差異有顯著性。
醛類物質(zhì)可在酸性介質(zhì)中與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)形成較穩(wěn)定的希夫堿, 本實驗中生成的2,4-二硝基苯腙,反應(yīng)式如下:
衍生劑用量和酸性是影響衍生反應(yīng)的重要因素。適量的酸有助于促進甲醛與2,4-二硝基苯肼的反應(yīng)[18-19],然而過多的酸將會損壞毛細管柱。稱取0.1 g 2,4-二硝基苯肼溶解于24 mL濃鹽酸中,加水定容至100 mL。
2.2.1 色譜柱的選擇
選用DB-5彈性石英毛細管柱,因其較好的惰性與柔性,吸附和催化性較小,適于目標(biāo)化合物的分析。
2.2.2 柱溫的選擇
預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)選擇210 ℃恒溫時,衍生物的出峰時間較早,峰形矮胖且分岔,檢測靈敏度不高。當(dāng)采用程序升溫,以10 ℃/min升溫速度升至150 ℃,然后升溫至260 ℃,恒溫5 min。出峰時間在18 min左 右,峰形與重復(fù)性較好,靈敏度也較高。
2.2.3 測定方法與特征離子的選擇
由于煙熏臘肉基體復(fù)雜,用高效液相色譜或氣相色譜法測定基質(zhì)干擾較大,結(jié)果往往偏高。通常需層析柱再進行洗脫凈化,操作繁瑣?;厥章时容^低。故選用氣相色譜-質(zhì)譜選擇離子檢測,這樣可消除雜質(zhì)對檢測的干擾,選擇性明顯提高。靈敏度比全掃描模式提高兩個數(shù)量級。衍生產(chǎn)物2,4-二硝基苯腙的質(zhì)譜圖見圖1。2,4-二硝基苯腙的碎片離子豐度中最大的峰為m/z 63,其次為m/z 79,且兩者差距不大,分子離子峰為m/z 210。根據(jù)選擇離子的原則,應(yīng)盡量選擇質(zhì)荷比較大的特征離子,以提高準確度;同時選擇豐度較大的離子,以提高檢測的靈敏度。如圖2所示,選擇離子掃描可很好地排除雜質(zhì)峰的干擾。綜上考慮,選擇m/z 79和m/z 210為參考檢測離子,以消除雜質(zhì)峰的干擾影響,保證檢測的準確性與靈敏度。
圖 1 2,4-二硝基苯腙的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of 2,4-dinitrobenzene formaldehyde hydrazone
圖 2 總離子流和特征離子色譜圖Fig.2 Total ion current and selected ion chromatograms
2.3.1 衍生劑用量
圖 3 峰面積隨衍生試劑用量變化的曲線Fig.3 Peak area vs. derivatization agent dosage
理論上,任何能與羰基反應(yīng)的大分子有機物質(zhì)都可以作為本實驗的衍生化試劑。綜合篩選,本實驗選用2,4-二硝基苯肼做為衍生劑,其主要特點是相對分子質(zhì)量適中,在常溫條件下反應(yīng)完全、快速。由圖3可知,衍生產(chǎn)物的峰面積隨著衍生化試劑用量的增加,在0.3 mL之前呈上升的趨勢,0.3 mL之后呈下降的趨勢,幅度較小。在用量0.3 mL處,峰面積最大,所以50 μL甲醛添加量的最佳衍生劑用量為0.3 mL。
2.3.2 衍生化時間
由圖4可見,隨著衍生化時間的延長,2,4-二硝基苯腙產(chǎn)物的峰面積增大,但并非呈一直增加的趨勢。當(dāng)衍生化時間在30 min以內(nèi)時,峰面積的響應(yīng)值隨時間的延長而增加,而隨后又下降,在30 min處達最高值。所以,衍生化時間選擇30 min。
圖 4 峰面積隨衍生化時間變化的曲線Fig.4 Peak area vs. derivatization time
2.3.3 衍生化溫度
圖 5 峰面積隨衍生化溫度變化的曲線Fig.5 Peak area vs. derivatization temperature
由圖5可見,隨著衍生化溫度的升高,2,4-二硝基苯腙產(chǎn)物的峰面積增大,但并非是一直增大,當(dāng)衍生化溫度在60 ℃以內(nèi)時,峰面積的響應(yīng)值隨溫度的升高而增加,而隨后又下降,在60 ℃條件下達最高值。所以,衍生化溫度選擇60 ℃。對于更準確具體的最適衍生溫度,可以進行進一步的探索。
2.3.4 萃取次數(shù)
二氯甲烷的用量和萃取的次數(shù)直接影響衍生物萃取率,從而間接影響測定的結(jié)果。實驗中第1次萃取用2 mL,隨后的每次用量為1 mL。如圖6顯示,2 次萃取后,萃取基本完全。盡管二氯甲烷是色譜級,但過多的萃取劑二氯甲烷仍會多帶入一些雜質(zhì),從而影響結(jié)果的準確性。所以,從檢測準確性與成本考慮選擇二氯甲烷萃取,第1次萃取用2 mL,隨后的每次用量為1 mL,萃取2 次。
圖 6 峰面積隨萃取次數(shù)變化的曲線Fig.6 Peak area vs. extraction number
按照1.3.1節(jié)方法,以甲醛質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線,得回歸方程為y=22 974.8x-0.194 63,R2=0.999 7,在甲醛反應(yīng)液質(zhì)量濃度為0.1~15 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.5.1 加標(biāo)回收率
在臘肉樣品中(本底不含有甲醛)分別加入相當(dāng)于樣品質(zhì)量分數(shù)分別為0.5、1.5、5 mg/kg的甲醛標(biāo)樣進行測定,計算出回收率結(jié)果見表1。
表 1 臘肉制品中甲醛加標(biāo)回收率Table 1 Recoveries and precision (RSD) for formaldehyde standard added to smoked meat
2.5.2 重復(fù)性實驗
按照1.3.6節(jié)方法處理,重復(fù)6 次實驗,得到相對標(biāo)準偏差為2.89%。表明本法具體很好的重復(fù)性。
2.5.3 檢出限
按上述分析方法,在不含甲醛的樣品本底中添加一定量的甲醛標(biāo)準進行實驗,最低檢測質(zhì)量濃度0.01 mg/L,以取樣量2.0 g計,本法對樣品的檢出限為0.50 mg/kg。
從重慶與湖南購買4 個品牌的臘肉,每個品牌購買3 袋,按照1.3.2、1.3.3節(jié)的方法進行前處理衍生化,按照1.3.4節(jié)的色譜條件進行測定,每個樣品取表層(表面0.5 cm厚)與內(nèi)部各3 份,每份平行測定3 次,取平均值,所測樣品中甲醛的含量結(jié)果見表2。利用所建立的方法對市售臘肉中甲醛含量進行了分析,4 種臘肉表層與內(nèi)部均存在著一定量的甲醛。從表2可以看出,所檢測的熏肉制品中甲醛含量均較高,最高甚至達到了254.52 mg/kg。煙熏臘肉表層甲醛含量要大于內(nèi)部。
表 2 不同樣品臘肉甲醛的含量Table 2 Formaldehyde contents of different smoked meats mg/kg
現(xiàn)在關(guān)于食品中甲醛的測定的研究主要集中在啤酒、蘑菇、海產(chǎn)品等樣品,李軍[20]、王宏華[21]等對啤酒中甲醛含量的測定進行研究,鄭斌[22]、迂君[23]等對水產(chǎn)品、海產(chǎn)品中甲醛測定開展相應(yīng)研究,還有研究者用衍生-液相色譜法檢測香菇中的甲醛含量。而熏肉制品中的甲醛檢測方法卻鮮有報道。熏肉制品由于質(zhì)地較干硬、存在著脂肪與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾,使得甲醛的提取存在著一定的困難。
在酸性環(huán)境中,甲醛極易揮發(fā)出來,影響測定結(jié)果,水蒸氣蒸餾可以很好解決這一問題。本實驗在傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾裝置的基礎(chǔ)上進行了改進,將原來的圓底燒瓶換成了半微量的定氮整流器,有效地降低了樣品量,從而提高回收率。實驗對衍生化以及萃取處理的條件進行了優(yōu)化,具體有衍生劑用量、衍生化時間、衍生化溫度、萃取次數(shù)4 個因素,這些因素直接影響的檢測的結(jié)果。
衍生劑用量過少,衍生化不充分,過多,因為衍生劑本身的純度則會給樣品帶來新的雜質(zhì),而衍化時間過長衍生溫度過高,則會影響衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性。混合液萃取2 次以后,峰面積增加不顯著。結(jié)合實驗結(jié)果,選擇加入0.3 mL 2,4-二硝基苯肼、衍生化溫度60 ℃、衍生化時間30 min、用二氯甲烷進行萃取、萃取2 次。
目前在甲醛檢測方法的研究中,各研究者所研究的研究對象各不相同,再加上儀器設(shè)備條件參差不齊,因此每個方法各有側(cè)重點,也各有優(yōu)劣。與其他甲醛檢測的方法相比,本方法色譜條件更為簡單,前處理對樣品本身的物理特性依賴性小。從方法學(xué)評價結(jié)果來看,樣品的干擾基質(zhì)少,具有較低的檢測限以及較好的回收率和精密度,能夠滿足檢測的要求。
實際樣品中甲醛含量的測定結(jié)果表明有些煙熏臘肉的甲醛含量令人堪憂,如何在保留傳統(tǒng)煙熏肉制品獨特風(fēng)味的基礎(chǔ)上降低或消除甲醛的安全風(fēng)險,已成為對傳統(tǒng)煙熏肉制品發(fā)展的一個挑戰(zhàn)。
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