王 葦，秦 瑤，周 霞，屈勇剛，王禮偉，郭秉嬌，王熙楚，李 劼，王曉蘭

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003）

益生菌是通過(guò)定植作用改變宿主某一部位菌群組成、從而產(chǎn)生有利于宿主健康作用的單一或組成明確的混和微生物，目前廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、醫(yī)療保健和畜牧業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域［1-4］。我國(guó)允許作為生態(tài)制劑的微生物有乳酸菌、糞腸球菌、芽胞桿菌和酵母菌等?？莶菅堪麠U菌作為一種主要的益生菌，以其具有生物奪氧、拮抗致病微生物，改善體內(nèi)外生態(tài)環(huán)境、增強(qiáng)動(dòng)物體的免疫功能、產(chǎn)生多種消化酶、產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用［5］，已成為目前飼料添加劑中最富有活力的產(chǎn)品。

枯草芽胞桿菌應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)良菌株的篩選以及菌株的安全性是關(guān)鍵。為此，本研究基于16SrRNA基因序列分析進(jìn)一步確定分離于雞糞便的13株枯草芽胞桿菌，通過(guò)一系列手段篩選性狀優(yōu)良的枯草芽胞桿菌，同時(shí)進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)，為后期的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供有用數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 疑似枯草芽胞桿菌13株，分離于石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院試驗(yàn)站飼養(yǎng)的雜交肉雞糞便，并通過(guò)形態(tài)學(xué)和生化試驗(yàn)進(jìn)行了初步鑒定。

1.1.2 試劑 抗菌藥物紙片：哌拉西林、阿米卡星、四環(huán)素、諾氟沙星、氨曲南、多黏菌素B、復(fù)方新諾明、特治星、甲氧芐啶、氟苯尼考均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；LB固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基：按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康小鼠，體重33g±3g，由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 提取細(xì)菌DNA模板 參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。

1.2.2 16SrRNA PCR擴(kuò)增與測(cè)序 應(yīng)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上、下游引物k1與k2。k1：5-GCGGCTTCGGCTGTCACTTAT-3，k2：5-CTTCGCCACTGGTGTTCCTCC-3，目的片段長(zhǎng)為439bp，由北大華大基因工程有限公司合成。PCR產(chǎn)物交由北大華大基因工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列比較分析 測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行16SrRNA序列比對(duì)分析，同源性大于99%的細(xì)菌判定為同種細(xì)菌；同源性介于95%～99%判定為同屬；同源性在91%～95%判定為同科［7］。最終應(yīng)用DNA Star軟件對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 菌株生物學(xué)特性測(cè)定 菌株耐酸能力測(cè)定、菌株耐膽汁鹽能力測(cè)定 、菌株耐高溫能力測(cè)定均參照文獻(xiàn)［8-9］進(jìn)行；采用常規(guī)K-B法選擇常用的10種抗菌藥物對(duì)菌株進(jìn)行抗菌藥物敏感性測(cè)定。

1.2.5 分離株的安全性評(píng)價(jià) 小鼠隨機(jī)分成A1、A2、B1、B2共4個(gè)組，每組10只。A1組腹腔注射0.3mL菌液（活菌數(shù)量為1.6×109CFU／mL），A2組腹腔注射相同劑量滅菌LB肉湯作為對(duì)照；B1組口服0.4mL菌液（活菌數(shù)量為1.6×109CFU／mL），B2組口腔灌服滅菌的LB肉湯0.4mL作為對(duì)照，連喂3d。7d后，定期觀察小鼠精神狀況、食欲、活動(dòng)、糞便等。最后稱重并處死小鼠，取出臟器，并稱量，求臟器系數(shù)［10］，觀察各臟器病理變化。

臟器系數(shù)＝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某臟器的重量／動(dòng)物體重

小鼠試驗(yàn)前后體重、小鼠增重以及各內(nèi)臟臟器系數(shù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株的PCR結(jié)果

13株菌株中有10株菌株擴(kuò)增到了大約439bp基因片段，分別命名為Q01-Q10（圖1）。

2.2 菌株的16SrRNA測(cè)序結(jié)果

圖1 枯草芽胞桿菌PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of Bacillus subtilis

10株菌PCR擴(kuò)增片段測(cè)序后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中枯草芽胞桿菌（登錄號(hào)：NC000964）序列比對(duì)，同源性均在90%以上。其中，Q04、Q05、Q09為99%，Q01、Q08為95%，而其余5株菌為94%（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明10株枯草芽胞桿菌16SrRNA序列處于不同分支，Q04、Q05、Q09在同一分支上。

圖2 分離株P(guān)CR擴(kuò)增片段同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果Fig.2 The homology and phylogenetic analysis results of PCR amplification fragments of isolates

2.3 菌株的生物學(xué)特性

2.3.1 菌株耐酸和耐膽鹽能力 Q04、Q05及Q09在pH為2.5時(shí)活菌數(shù)最多。其中Q04在pH2.5的情況下，0～2h時(shí)細(xì)菌數(shù)量有較大幅度的增加，2h～4h時(shí)細(xì)菌數(shù)量則出現(xiàn)顯著的下降，在4h～6h時(shí)細(xì)菌數(shù)量再次增加（圖3）。Q04在膽鹽濃度為2.0g／L時(shí)活菌數(shù)最多（圖4）。

2.3.2 菌株耐高溫能力 Q04、Q05及Q09可以在50℃～100℃很好的耐高溫，其中Q04對(duì)溫度的耐受能力高于Q05和Q09。特別是在100℃處理后，Q04的存活率顯著高于其他2個(gè)菌株。

2.3.3 菌株對(duì)抗菌藥物敏感性 3株枯草芽胞桿菌對(duì)氨曲南、復(fù)方新諾明以及甲氧芐啶耐受程度較高，而對(duì)哌拉西林、阿米卡星、四環(huán)素、諾氟沙星、特治星、氟苯尼考敏感。而Q04對(duì)于多黏菌素具有耐受性，其他2個(gè)菌株則對(duì)多黏菌素較為敏感（表1）。

2.4 菌株對(duì)小鼠的安全性

試驗(yàn)期間，小鼠均存活且小鼠體征均未見(jiàn)明顯變化，各組小鼠體重均有增加，但A1與A2、B1與B2比較均無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表2）。剖解小鼠，檢測(cè)心、肝、脾、肺、腎、腦等各臟器，肉眼觀察并無(wú)明顯異常。同時(shí)A1與A2、B1與B2臟器系數(shù)相比較均無(wú)明顯差異（P＞0.05）（表3）。

表1 3株枯草芽孢桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性Table 1 The antimicrobial sensitivity results of 3 Bacillus subtilis isolates 個(gè)

圖3 枯草芽胞桿菌Q04對(duì)不同pH酸的耐受結(jié)果Fig.3 The tolerable results of Q04to acid of different pH

表2 腹腔注射和口腔灌服處理前后體重差異比較Table 2 Comparison of difference in weight of mice before and after intraperitoneal injection and oral gavage g

3 討論

芽胞桿菌傳統(tǒng)上分類鑒定多依照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，其中個(gè)體形態(tài)和生理生化反應(yīng)方法是最經(jīng)典、最常用的芽胞桿菌分類鑒定指標(biāo)，但傳統(tǒng)方法只能初步確定［11］。Ibrahim等對(duì)B.pallidus進(jìn)行16S rRNA測(cè)序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，得出其與芽胞桿菌屬有很大的區(qū)別，與Geobacillus很相近，故將它歸入Geobacillus［12-14］。利用傳統(tǒng)方法結(jié)合該技術(shù)可以更準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌［12］。本試驗(yàn)將雞糞便中分離并通過(guò)細(xì)菌形態(tài)特征、染色鏡檢觀察及生化鑒定獲得13株芽胞桿菌，通過(guò)16SrRNA進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，最終確認(rèn)3株為枯草芽胞桿菌。

圖4 枯草芽胞桿菌Q04對(duì)不同濃度膽鹽的耐受結(jié)果Fig.4 The tolerable results of Q4to bile salt of different concentrations

表3 試驗(yàn)小鼠不同臟器系數(shù)比較Table 3 Comparison of different organ coefficients in mice

枯草芽胞桿菌已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如何保證菌株在動(dòng)物體內(nèi)的存活率及菌群數(shù)量尤為重要。本試驗(yàn)對(duì)3株枯草芽胞桿菌進(jìn)行了耐高溫、耐膽鹽、耐酸以及對(duì)抗菌藥物敏感性生物學(xué)特性研究，其中Q04對(duì)抗菌藥物敏感性與其他2株枯草芽胞桿菌差異性不大，通過(guò)綜合分析Q04具有良好的生物學(xué)特性。益生菌使用的安全性是另外一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如菌株的內(nèi)在特性、菌株的藥物代謝動(dòng)力學(xué)、菌株與宿主之間的相互關(guān)系等［15］?？梢酝ㄟ^(guò)臟器系數(shù)、半數(shù)致死量、急性毒性、最小致死量、最大耐受量、體重變化等試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)［16-18］。臟器系數(shù)的差異性可反映對(duì)臟器的毒性綜合情況，也是尋找毒性作用靶器官的重要線索［17］。體重是動(dòng)物試驗(yàn)中重要的非特異性觀察指標(biāo)，可綜合反映動(dòng)物機(jī)體中毒效應(yīng)，是動(dòng)物試驗(yàn)重要指標(biāo)之一［18］。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃或腹腔注射枯草芽胞桿菌Q04的小鼠均健康存活，生理學(xué)特征和臟器系數(shù)未見(jiàn)異常，體重較對(duì)照組有所增加。也有研究將2株芽胞桿菌飼喂小鼠，其結(jié)果顯示臟器系數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）［19］。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，由此推斷枯草芽胞桿菌Q04對(duì)小鼠是安全的。

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