顧海娟，王星果，王慧娟，邵 芳，顧志良

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育受體內(nèi)外各種因素的作用，并由機(jī)體的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的生長(zhǎng)軸進(jìn)行調(diào)控.生長(zhǎng)軸是由“下丘腦—垂體—（生長(zhǎng)激素）—靶器官”上有關(guān)激素及受體組成的神經(jīng)內(nèi)分泌軸.GH經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)至靶組織或器官，通過(guò)兩種方式發(fā)揮作用：一是直接作用，GH直接與細(xì)胞膜表面的生長(zhǎng)激素受體（growth hor?mone receptor，GHR）結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而參與靶器官的代謝活動(dòng)，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育；二是間接作用，GH先與靶細(xì)胞表面的GHR結(jié)合，作用于靶器官，產(chǎn)生類胰島素生長(zhǎng)因子（insulin-like growth fac?tors，IGFs），后者再通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌或自分泌途徑作用于肌肉和骨骼等靶器官，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[1].雞的生長(zhǎng)也不例外，同樣依靠生長(zhǎng)軸的作用來(lái)調(diào)節(jié)自身的生長(zhǎng).

類胰島素生長(zhǎng)因子，是生長(zhǎng)激素產(chǎn)生生理作用過(guò)程中必須的一種活性蛋白多肽物質(zhì)[2].IGF-I是一種含有70個(gè)氨基酸的堿性單鏈多肽，廣泛存在于機(jī)體組織中，具有調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、免疫和機(jī)體代謝的功能[2].雞IGF-I的一級(jí)結(jié)構(gòu)首先由Rinderkneeht和Humkel（1978）闡明，與胰島素49%同源[3].1996年，Klein等通過(guò)原位雜交和遺傳連鎖分析，將雞的IGF-I基因定位在1號(hào)染色體的短臂近著絲粒處.Yoshitaka Kaji?moto等（1991）通過(guò)對(duì)雞的IGF-I基因進(jìn)行克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)其組成是4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度為50 kb，且成熟的IGF-I多肽由外顯子2、3編碼，而外顯子1、4分別編碼N末端和C末端及一些非編碼序列.因?yàn)檫x擇性剪接和選擇性加尾，雞的IGF-I基因會(huì)產(chǎn)生兩條不同的mRNA[4].

動(dòng)物肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育與IGFs系統(tǒng)基因的時(shí)空特異性表達(dá)密切相關(guān)[5-7]，但目前關(guān)于其發(fā)育表達(dá)模式的資料較少，肉雞不同組織和肌肉、脂肪和肝臟IGFs基因表達(dá)的發(fā)育性變化模式還有待進(jìn)一步探討.對(duì)于IGFs發(fā)育表達(dá)模式的研究，將有助于了解動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中激素調(diào)控的本質(zhì).本實(shí)驗(yàn)選取不同發(fā)育時(shí)期的白羽AA肉雞（八個(gè)不同發(fā)育階段，各階段3個(gè)樣品，總共24個(gè)樣品），通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)來(lái)研究肉雞IGF-I基因mRNA的時(shí)空表達(dá)特征.實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為研究IGF-I基因在肉雞發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供資料，為揭示IGF-I基因在肉雞早期生長(zhǎng)發(fā)育中的功能奠定一定的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本研究采集出生后1日齡及1周齡、2周齡、3周齡、4周齡、5周齡、6周齡、7周齡的AA白羽肉雞（每周齡分別選取三只樣品雞，總共24只樣品雞）胸肌、腿肌、脂肪、心臟、肝臟、脾、肺、腎、腸、腺胃、肌胃和腦12個(gè)組織樣品，迅速置于液氮中速凍，并于-80℃冰箱中保存.用TRIzol試劑提取不同組織和不同發(fā)育時(shí)期肌肉、脂肪、肝臟的總RNA.

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的雞IGF-I和β-actin基因序列設(shè)計(jì)引物chiIGF1F1：5′-TTAACCAGTTCTGCTGCTGC-3′chiIGR1：5′-TGGTGTAAGCGTCTACTGCT-3′；dubactinqF：5′-CACGGTATTGTCACCAACTG-3′，dubactinqR：5′-ACAGCCTGGATGGCTACATA-3′.引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.3 IGF-I基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

采用兩步PCR法進(jìn)行熒光定量PCR.對(duì)RNA樣品首先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系：Power SYBR Green PCR Master Mix 10μl，正反向引物（10 μmol/L）各 1 μl，去離子無(wú)菌水6.67 μl，RT產(chǎn)物1.33 μl.反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 1 min，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析，溫度以0.5℃/30 S的速率從55℃緩慢遞增到95℃.

1.4 數(shù)據(jù)收集和分析

本實(shí)驗(yàn)選擇相對(duì)定量熒光PCR法，通過(guò)在不同組織中內(nèi)標(biāo)β-actin和目標(biāo)基因IGF-1分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，測(cè)定其Ct值，根據(jù)相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 2-ΔCt值法，算出每個(gè)樣品中IGF-1基因與β-actin基因表達(dá)的相對(duì)值.在Excel中作出IGF-1mRNA相對(duì)于β-actin表達(dá)量的柱狀圖.并用SPSS12.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn).實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞IGF-I和β-actin基因的RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)

隨機(jī)選取總RNA樣品，首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以獲得肉雞的cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的預(yù)實(shí)驗(yàn).即選用IGF-I、β-actin這兩對(duì)引物，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物是否進(jìn)行了特異性的擴(kuò)增.經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶均位于DNA Marker 100～250 bp之間，且擴(kuò)增條帶大小與設(shè)計(jì)相符，說(shuō)明目的基因得到了PCR擴(kuò)增，而且產(chǎn)物特異性非常好，故可以用于熒光定量PCR檢測(cè).

2.2 肉雞不同組織中IGF-I基因mRNA表達(dá)

IGF-I基因mRNA在4周齡肉雞的12個(gè)組織中的表達(dá)呈現(xiàn)組織差異性.在肝臟中IGF-I基因mRNA表達(dá)量最高，顯著高于其余11個(gè)組織的表達(dá)量；表達(dá)量次之的是肺，但其量相對(duì)于肝臟中的表達(dá)還是較少的；其次在胸肌、腿肌、心肌中的表達(dá)量均稍低于肺；在脂肪、脾、腺胃、肌胃、腸、腦中的表達(dá)量都很少，脂肪、腦中的表達(dá)量相對(duì)于脾、腺胃、肌胃、腸略高，在脾這些組織中表達(dá)極微量；而在腎臟中未檢測(cè)到有IGF-I基因mRNA的任何表達(dá).肝臟中IGF-I mRNA的表達(dá)與其余各組織的表達(dá)量均存在顯著差異，說(shuō)明其表達(dá)量顯著高于其他組織.可知4周齡肉雞的肝臟中大量表達(dá)IGF-I基因，這些高表達(dá)的IGF-I可以以內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌作用來(lái)調(diào)控肝臟的生長(zhǎng)發(fā)育（見(jiàn)圖2）.

圖1 IGF-I和β-actin的PCR擴(kuò)增片段(M：DL-2000 DNA marker)

圖2 雞IGF-I基因的mRNA在12種不同組織的表達(dá)

2.3 肉雞不同發(fā)育時(shí)期的IGF-I基因mRNA表達(dá)

各發(fā)育時(shí)期的腿肌中表達(dá)量最高的是6周齡；其次是4周齡，其表達(dá)量比6周齡時(shí)的表達(dá)略低；在1、3、5周齡時(shí)的表達(dá)量相近；在2周齡時(shí)的表達(dá)比在1、3、5周齡中的表達(dá)量少些；然后是7周齡時(shí)的表達(dá)，其又少于2周時(shí)期；出生后1日齡的個(gè)體表達(dá)量最少，呈微量.經(jīng)顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1日齡的表達(dá)量與3、4、6周齡時(shí)的表達(dá)量存在顯著差異，7周與4、6周齡的表達(dá)量呈顯著性差異.說(shuō)明這些時(shí)期的表達(dá)量相差較大，IGF-I在不同時(shí)期腿肌的發(fā)育中均有著重要作用，見(jiàn)圖3.

脂肪中3周齡個(gè)體的IGF-I基因mRNA表達(dá)量最高，明顯高于其他各時(shí)期；4、5周齡的表達(dá)量相似，但5周時(shí)表達(dá)比4周時(shí)略高；其次是6周個(gè)體的表達(dá)，約是4周的1/2；而在7周時(shí)呈極微量表達(dá).就整體趨勢(shì)而言是隨著年齡的增長(zhǎng)其表達(dá)量而隨之減少.3周與7周間的表達(dá)呈顯著差異，3周的表達(dá)量顯著高于7周.提示IGF-I對(duì)肉雞脂肪組織的作用主要體現(xiàn)在發(fā)育早期，見(jiàn)圖4.

圖5顯示肝臟中表達(dá)量最高的是3周齡的個(gè)體；其次是2周個(gè)體，其表達(dá)量比3周的略少；5周齡個(gè)體的表達(dá)量比2周齡少，表達(dá)量較中；4、6、7周齡個(gè)體的表達(dá)量相似，但是7周時(shí)比其他兩個(gè)時(shí)期少；在1周齡時(shí)呈微量表達(dá)；而出生后1日齡時(shí)表達(dá)量呈極微量.在肝臟中IGF-I表達(dá)的整體趨勢(shì)相近于剛出生時(shí)IGF-I mRNA的表達(dá)量，隨年齡增大其表達(dá)量逐漸增加，但到一定時(shí)期其表達(dá)量又趨近平穩(wěn).與腿肌、脂肪的同一發(fā)育時(shí)期相比，其IGF-I基因mRNA的表達(dá)顯著高于二者.肝臟中IGF-I基因mRNA發(fā)育性表達(dá)不表現(xiàn)顯著差異.

圖3 腿肌不同發(fā)育時(shí)期IGF-I基因mRNA的表達(dá)量

圖4 脂肪不同發(fā)育時(shí)期IGF-I基因mRNA的表達(dá)量

3 討論

GH的重要調(diào)節(jié)作用，其除了與靶組織、器官的GHR結(jié)合而直接發(fā)揮其促生長(zhǎng)作用外，還可以促進(jìn)靶器官產(chǎn)生IGF-I.IGF-I以內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌的形式促進(jìn)各組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育.同樣，雞的GH也需要與受體有效結(jié)合，并最終依賴IGFs的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其促生長(zhǎng)作用.

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，4周齡肉雞的12個(gè)不同組織中，肝臟的IGF-I表達(dá)量最高，與其余11個(gè)組織中的表達(dá)量均存在顯著差異，說(shuō)明肝臟是產(chǎn)生IGF-I的主要場(chǎng)所，是IGF-I發(fā)揮內(nèi)分泌、自分泌、旁分泌的主要靶器官.除肝臟外，在胸肌、腿肌、脂肪、心肌、肺、腦中均有少量表達(dá)，而在腺胃、肌胃、腸中僅有微量表達(dá)，但在腎臟中沒(méi)有表達(dá).說(shuō)明雞個(gè)體的許多組織器官均可產(chǎn)生IGF-I，從而發(fā)揮其自分泌、旁分泌作用.

圖5 肝臟不同發(fā)育時(shí)期IGF-I基因mRNA的表達(dá)量

IGF-I在肌肉中的過(guò)量表達(dá)可顯著促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育，這已在轉(zhuǎn)基因鼠和雞上得到證實(shí)[8].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示IGF-I基因mRNA在腿肌中出生后表達(dá)量呈不同程度的增加，在六周齡時(shí)達(dá)到最大值，七周齡時(shí)開(kāi)始下降.從出生后1周到6周，其IGF-I基因mRNA的表達(dá)量均較高，3、4、6周時(shí)表達(dá)量與剛出生1天的個(gè)體表達(dá)量出現(xiàn)顯著差異，說(shuō)明這些時(shí)期的肌肉生長(zhǎng)需要大量的IGF-I作用.而該段時(shí)間也是雞腿肌逐漸發(fā)育的時(shí)期，由此表明，在雞腿肌發(fā)育較快時(shí)期，腿肌中IGF-I表達(dá)量也相應(yīng)較高，說(shuō)明IGF-I對(duì)腿肌的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用.這一結(jié)果與王勇生等在北京鴨胸肌中IGF-I的發(fā)育性表達(dá)變化研究結(jié)論相似[8].說(shuō)明IGF-I對(duì)禽類的肌肉生長(zhǎng)具有重要作用.Duclos（2005）發(fā)現(xiàn)雞肌肉組織IGF-1的自分泌對(duì)其生長(zhǎng)起主要作用.有研究發(fā)現(xiàn)，使用促進(jìn)劑使IGF-I基因的表達(dá)僅限制在骨骼肌時(shí)，會(huì)出現(xiàn)顯著的肌肉營(yíng)養(yǎng)過(guò)?，F(xiàn)象，但體重與血清IGF-I濃度并未增加，表明局部產(chǎn)生的IGF-I可在動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[8].因此，推測(cè)雞腿肌組織產(chǎn)生的IGF-1對(duì)雞腿肌的發(fā)育也具有局部效應(yīng)，其可以明顯促進(jìn)雞腿肌的生長(zhǎng)發(fā)育.

肝臟是IGF-I的主要分泌器官.IGF-I的表達(dá)量在出生早期較少，隨年齡增大其表達(dá)量也逐漸增加，但到一定時(shí)期其表達(dá)量又趨近平衡，各時(shí)期的表達(dá)無(wú)顯著差異，說(shuō)明IGF-I在肝臟早期生長(zhǎng)發(fā)育的各階段均具有一定的作用.劉國(guó)慶等[9]在羔羊肝臟中對(duì)IGF-I和IGF-IR基因表達(dá)的發(fā)育性變化研究中得出的結(jié)論也是IGF-I的表達(dá)量先是隨年齡的增大其量也增加，然后再逐漸下降，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相似.

體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)均表明，IGF-I可能是脂肪細(xì)胞增殖和分化所必需的關(guān)鍵因子之一，IGF-I可能通過(guò)內(nèi)分泌或（和）旁（自）分泌促進(jìn)脂肪組織的發(fā)育[10].在雞脂肪的不同發(fā)育時(shí)期IGF-I基因mRNA的表達(dá)量是隨著周齡的上升而呈漸漸下降的趨勢(shì)，7周的表達(dá)量與3周的量存在顯著性差異，說(shuō)明脂肪細(xì)胞的增值主要發(fā)生于生長(zhǎng)早期.提示IGF-I主要在雞生長(zhǎng)發(fā)育的早期促進(jìn)脂肪細(xì)胞的增殖和分化.這與周杰等[11]在二花臉和大白豬的脂肪組織中GHR、IGF-I和IGF-IR基因表達(dá)的發(fā)育性變化研究中的結(jié)果相同.

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