李健，王鵬舉，崔云鳳，鄒培建，秦剛1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

檢測(cè)Sortase A酶催化蛋白質(zhì)連接效率的新型報(bào)道系統(tǒng)

李健1,2，王鵬舉1,2，崔云鳳2，鄒培建2，秦剛2
1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457 2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

利用分子進(jìn)化技術(shù)對(duì)Sortase A酶的催化活性進(jìn)行定向改造已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)，為了高效篩選特定催化活性的Sortase A酶突變體，需要建立一種能夠快速準(zhǔn)確鑒定Sortase A酶活性的方法。為此，設(shè)計(jì)了由GFP-LPETG蛋白和GGGYK-Biotin組成的新型報(bào)道底物系統(tǒng)。利用重組基因工程技術(shù)，成功制備GFP-LPETG蛋白，野生型Sortase A酶及近期報(bào)道的一個(gè)高活性突變型Sortase A酶。以GFP-LPETG及GGGYK-Biotin為報(bào)道底物建立連接體系，結(jié)果顯示，連接反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可直接通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳法精確測(cè)定。用此連接體系比較野生型與突變型Sortase A酶催化的連接反應(yīng)效率，證實(shí)高活性突變酶具有野生酶無(wú)法比擬的高催化活性。此報(bào)道系統(tǒng)簡(jiǎn)單快速靈敏，可應(yīng)用于系統(tǒng)的篩選，為后續(xù)進(jìn)一步定向優(yōu)化Sortase A酶奠定了基礎(chǔ)。

Sortase A酶，連接反應(yīng)效率，報(bào)道底物，GFP-LPETG蛋白，GGGYK-Biotin，高活性突變體

蛋白質(zhì)連接技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，根據(jù)其反應(yīng)特征可分為化學(xué)連接法和酶催化連接法[1–2]。目前，化學(xué)連接法在蛋白質(zhì)連接技術(shù)中仍發(fā)揮重要作用，但存在制備工藝復(fù)雜、對(duì)蛋白質(zhì)活性有損傷、連接產(chǎn)物不均一等問(wèn)題，相比而言，以Sortase酶為代表的酶催化蛋白質(zhì)連接法展現(xiàn)出反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)效率高、底物特異性強(qiáng)等明顯優(yōu)勢(shì)，代表了蛋白質(zhì)連接技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

Sortase酶是一組存在于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中介導(dǎo)表面蛋白與細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合的蛋白酶，負(fù)責(zé)細(xì)胞表面蛋白的修飾和細(xì)菌鞭毛的構(gòu)建[3–7]。當(dāng)前研究最廣泛的是來(lái)自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus的Sortase A酶 (EC 3.4.22.70)，其結(jié)構(gòu)、功能及催化原理已有透徹研究[8–14]。Sortase A酶具有一個(gè)典型的類(lèi)似Ⅱ型膜蛋白的N端跨膜區(qū)域和C端富集正電荷的尾巴。此酶催化C端含有LPxTG (x代表任一種氨基酸殘基) 序列的底物，與N端含有寡聚Gly序列的底物進(jìn)行連接反應(yīng)[15–17]。底物識(shí)別序列中的Leu和Pro通過(guò)疏水作用結(jié)合到Sortase A酶活性區(qū)域，導(dǎo)致識(shí)別序列中Thr與Gly形成的肽鍵靠近Sortase A酶活性中心的Cys184和Arg197[18]，Cys184和His120反向質(zhì)子化，促成Cys184的巰基攻擊Thr與Gly之間酰胺鍵的羰基，形成一個(gè)短暫的四面體氧負(fù)離子過(guò)渡狀態(tài)，Arg197的氫鍵作用有助于此狀態(tài)穩(wěn)定；Gly的離開(kāi)導(dǎo)致形成一個(gè)穩(wěn)定的?；?酶中間體，此中間體被另一底物的N端氨基親核攻擊，從而打破穩(wěn)定狀態(tài)，形成新的連接產(chǎn)物。另外，Sortase A酶存在一個(gè)鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)，鈣離子的存在會(huì)增加酶的催化效率[19–20]。

Sortase A酶催化的連接反應(yīng)因其便捷性，已被證實(shí)可應(yīng)用于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、肽、核酸類(lèi)似物、糖等活性物質(zhì)的連接，以及蛋白質(zhì)的固定化[21]，展示出良好的應(yīng)用前景。但天然Sortase A酶催化的連接反應(yīng)耗時(shí)長(zhǎng)、產(chǎn)率低，離大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用尚有一定距離。正因如此，不同實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了一系列對(duì)此酶的改造，包括提高酶催化活性及改變底物識(shí)別特征等[17,22-26]。最近，Chen等利用酵母展示系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)多輪篩選獲得了比野生型Sortase A酶活性高140多倍的突變體[25]。與野生型相比，此酶發(fā)生4個(gè)位點(diǎn)的突變：P94S、D160N、D165A和K196T，根據(jù)已知的三維結(jié)構(gòu)，突變位點(diǎn)全部位于底物結(jié)合區(qū)域附近，推測(cè)突變型酶更利于底物進(jìn)入結(jié)合區(qū)域，使得連接效率大大提升。而Piotukh等則成功利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得底物識(shí)別序列改變?yōu)锳PxTG的突變型Sortase A酶[26]。目前，檢測(cè)Sortase A酶突變體活性的方法有HPLC、MS、熒光成像法等，操作過(guò)程繁瑣且需要特殊設(shè)備[25-26]。

本研究旨在開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單靈敏的用于檢測(cè)連接反應(yīng)效率的報(bào)道底物系統(tǒng)，通過(guò)將此系統(tǒng)應(yīng)用于野生型及高活性突變Sortase A酶催化的連接反應(yīng)以證實(shí)該檢測(cè)系統(tǒng)的可靠性，為后續(xù)定向改造Sortase A酶提供通用的篩選鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌Escherichia coli DH5α、BL21(DE3) 購(gòu)于北京全式金生物科技有限公司；表達(dá)載體pET-24d(+)-GB1和pET-24d(+)-GFP為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖購(gòu)于天根生化科技 (北京) 有限公司；聚合酶Phusion Hot Start Ⅱ DNA 聚合酶，限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ和KpnⅠ，Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit，蛋白Marker均購(gòu)自Thermo Scientific公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)于全式金公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒和PCR高純度片段回收試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow購(gòu)于GE公司；人工合成短肽GGGYK-Biotin (分子量為707 Da，純度99%) 及GGGYK (分子量為481 Da，純度99%) 由北京中科亞光生物技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.2 方法

1.2.1 GFP-LPETG和野生型Sortase A基因片段的獲得

以質(zhì)粒pET-24d(+)GFP為模板，使用引物GFP For和GFP Rev (表1)，PCR擴(kuò)增GFP-LPETG基因片段。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。依據(jù)金黃色葡萄球菌中srtA基因序列 (GenBank Accession No. AF162687.1)，分別設(shè)計(jì)上下游引物 SrtA For和SrtA Rev (表1)，以提取的金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用上述方法擴(kuò)增編碼srtA基因61–221位的讀碼框。

1.2.2 pET-24d(+)-GFP-LPETG、pET-24d(+)-SrtA及pET-24d(+)-SrtAM表達(dá)載體的構(gòu)建

以NcoⅠ和KpnⅠ雙酶切處理經(jīng)瓊脂糖凝膠回收的GFP-LPETG的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與經(jīng) NcoⅠ和KpnⅠ雙酶切處理的pET-24d(+)載體片段連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E. coli DH5α，挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定，正確的克隆測(cè)序驗(yàn)證，命名為pET-24d(+)-GFP-LPETG。采用同樣方法構(gòu)建pET-24d(+)-SrtA載體。在其基礎(chǔ)上，利用Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit，依次采用引物P94S For/P94S Rev，D160N/ D165A For和D160N/D165A Rev，K196T For/ K196T Rev，對(duì)srtA基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，每輪突變后測(cè)序確證，最終獲得突變型酶Sortase A酶表達(dá)載體pET-24d(+)-SrtAM。

1.2.3 GFP-LPETG、Sortase A及突變型Sortase A酶的誘導(dǎo)表達(dá)

分別將表達(dá)載體pET-24d(+)-GFP-LPETG、pET-24d(+)-SrtA及pET-24d(+)-SrtAM 轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆在含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入IPTG 至0.2 mmol/L，于37 ℃誘導(dǎo)3 h。

表1 PCR引物的設(shè)計(jì)Table 1 Design of PCR primers

1.2.4 GFP-LPETG、Sortase A及突變型Sortase A酶的的親和純化

6 000 r/min、4 ℃離心15 min收集菌體。用緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，250 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑)重懸，高壓勻漿儀破碎菌體。裂解液中添加0.3% Triton X-100，4 ℃、16 000 r/min離心50 min，上清經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，使用自動(dòng)蛋白純化儀AKTA進(jìn)行Ni-NTA親和層析。目的蛋白經(jīng)20–250 mmol/L 咪唑線(xiàn)性梯度洗脫，SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。蛋白樣本經(jīng)4 ℃透析，超濾濃縮并測(cè)定濃度，于–80 ℃保存。

1.2.5 連接反應(yīng)效率檢測(cè)系統(tǒng)

在連接體系中分別加入1 μmol/L Sortase A酶 (野生型或突變型)，2 μmol/L GFP-LPETG蛋白及30 μmol/L 合成短肽GGGYK-Biotin (或合成短肽GGGYK)，37 ℃反應(yīng)，分別于設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取樣并終止反應(yīng)。所有樣本經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán) (Commassise blue R250)染色，脫色后電泳結(jié)果經(jīng)全自動(dòng)多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍照，利用LANE 1D軟件對(duì)相應(yīng)條帶進(jìn)行定量，計(jì)算連接效率。

圖1 報(bào)道底物設(shè)計(jì)Fig. 1 Design of reporter substrates.

2 結(jié)果與分析

2.1 報(bào)道底物設(shè)計(jì)

檢測(cè)Sortase A酶的催化活性，需要一種簡(jiǎn)單、快捷、靈敏的連接反應(yīng)效率分析系統(tǒng)。為實(shí)現(xiàn)此目的，根據(jù)Sortase A酶介導(dǎo)連接反應(yīng)的底物特征，將Sortase A酶識(shí)別序列LPETG引入GFP蛋白C端；另一底物則選用短肽GGGYK-Biotin (GGGYK作為對(duì)照)。預(yù)期連接產(chǎn)物為GFP-LPETGGGYK-Biotin，反應(yīng)過(guò)程如圖1所示。生物素分子的引入，是希望通過(guò)鏈霉親和素分子印跡法來(lái)實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)連接產(chǎn)物的生成。

2.2 pET-24d(+)-GFP-LPETG與pET-24d (+)- SrtA載體構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有GFP編碼的質(zhì)粒pET-24d(+)GFP為模板，PCR擴(kuò)增完整的GFP編碼片段，Sortase A酶識(shí)別序列LPETG的核酸編碼通過(guò)下游引物GFP Rev引入到擴(kuò)增片段3′端。結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小約750 bp，與預(yù)期相符 (圖2)。將PCR片段經(jīng)Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ位點(diǎn)插入質(zhì)粒pET-24d(+)，測(cè)序完全正確，命名為pET-24d(+)-GFP-LPETG。

先前報(bào)道指出，Sortase A酶N端60個(gè)氨基酸組成跨膜區(qū)域，截掉此跨膜區(qū)對(duì)酶活沒(méi)有顯著影響，卻更利于重組蛋白可溶性制備[27]。據(jù)此，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，利用PCR成功擴(kuò)增截短N(yùn)端60個(gè)氨基酸編碼的srtA基因片段，擴(kuò)增片段大小約450 bp，符合預(yù)期 (圖3) 。PCR片段經(jīng)Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ位點(diǎn)插入質(zhì)粒pET-24d(+)，測(cè)序驗(yàn)證與srtA基因序列完全一致，命名為pET-24d(+)-Srt A。

2.3 GFP-LPETG蛋白及野生型Sortase A酶的表達(dá)純化

將pET-24d(+)-GFP-LPETG及pET-24d(+)-SrtA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)，重組報(bào)道底物GFP-LPETG蛋白與野生型Sortase A酶主要以可溶形式存在。經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化，得到高純度的目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE，報(bào)道底物GFP-LPETG大小為36 kDa (圖4)，野生型Sortase A大小為26 kDa (圖5)。

圖2 GFP基因的PCR擴(kuò)增Fig. 2 PCR amplification of GFP gene. M: DNA molecular weight markers; 1: PCR product of GFP gene.

圖3 金黃色葡萄球菌srtA基因的PCR擴(kuò)增Fig. 3 PCR amplification of Staphylococcus aureus srtA gene. M: DNA molecular weight markers; 1: PCR product of srtA gene.

圖4 Ni-NTA柱親和純化GFP-LPETG的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified GFP-LPETG via Ni-NTA affinity chromatography. M: protein marker; 1: soluble fraction of whole cell lysate; 2: flowthrough; 3–4: wash; 5: elution of purified GFP protein.

圖5 Ni-NTA柱親和純化野生型Sortase A酶的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of purified wildtype Sortase A protein via Ni-NTA affinity chromatography. M: protein marker; 1: soluble fraction of whole cell lysate; 2: flowthrough; 3: purified Sortase A protein.

2.4 Sortase A酶介導(dǎo)的連接反應(yīng)效率分析系統(tǒng)的建立

分別將合成的底物短肽GGGYK及GGGYKBiotin，與GFP-LPETG蛋白組成連接反應(yīng)底物對(duì)，經(jīng)野生型Sortase A酶催化，SDS-PAGE凝膠電泳追蹤連接產(chǎn)物GFP-LPETGGGYK及GFP-LPETGGGYK-Biotin的形成。結(jié)果顯示，使用底物GGGYK進(jìn)行反應(yīng)，連接產(chǎn)物GFPLPETGGGYK與未反應(yīng)底物GFP-LPETG條帶過(guò)于接近，因而無(wú)法準(zhǔn)確判斷連接反應(yīng)進(jìn)程 (圖6，泳道8–13)。與此對(duì)照，使用底物GGGYK-Biotin進(jìn)行反應(yīng)，連接產(chǎn)物GFP-LPETGGGYK-Biotin與未反應(yīng)底物GFP-LPETG的SDS-PAGE電泳遷移率存在明顯差異，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)連接產(chǎn)物逐漸增多，并伴隨底物GFP-LPETG逐漸減少 (圖6，泳道1–6)。這表明，以GGGYK-Biotin與GFP-LPETG為報(bào)道底物的連接反應(yīng)體系，僅需SDS-PAGE凝膠電泳經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色就可以快速、靈敏地追蹤Sortase A酶催化的連接反應(yīng)進(jìn)程，最初設(shè)想的引入鏈霉親和素分子印跡步驟已無(wú)實(shí)施必要。

圖6 SDS-PAGE分析野生型Sortase A催化蛋白質(zhì)連接效率Fig. 6 SDS-PAGE assay monitoring ligation efficiency mediated by wildtype Sortase A. 1–6: ligation between GFP-LPETG and GGGYK-Biotin, with 0, 1, 2, 3, 4, 12 hours of reaction, respectively; 7: GFP-LPETG; 8–13: ligation between GFP-LPETG and GGGYK, with 0, 1, 2, 3, 4, 12 hours of reaction, respectively (: substrate GFP-LPETG; : ligation product GFP-LPETGGGYK-Biotin;: wildtype Sortase A).

圖7 Ni-NTA柱親和純化高活力突變型Sortase A酶的SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis of purified high activity mutant Sortase A protein via Ni-NTA affinity chromatography. M: protein marker; 1: purified high activity Sortase A mutant protein.

2.5 pET-24d(+)-SrtAM載體的構(gòu)建及突變型Sortase A酶的表達(dá)純化

GFP-LPETG與GGGYK-Biotin為報(bào)道底物的連接反應(yīng)體系中，野生型Sortase A酶僅顯示出較低的催化活性，連接反應(yīng)經(jīng)過(guò)12 h僅完成約30% (圖6，泳道6)，這與實(shí)際應(yīng)用仍有較大距離。為此，參照Chen等近期報(bào)道的高活性突變Sortase A酶序列[25]，以pET-24d(+)-SrtA為模板，依次對(duì)P94、D160、D165、K196位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，測(cè)序確認(rèn)定點(diǎn)突變成功，命名為pET-24d(+)-Srt AM。

將pET-24d(+)-SrtAM質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)。與野生型Sortase A酶類(lèi)似，重組突變型酶主要以可溶形式存在，采用Ni-NTA柱親和層析純化，得到高度純化產(chǎn)物：突變型Sortase A酶大小為26 kDa (圖7)，符合預(yù)期。

2.6 野生型及突變型Sortase A酶連接效率比較

利用已建立的GGGYK-Biotin與GFPLPETG報(bào)道底物連接體系 (見(jiàn)2.3)，在相同的反應(yīng)條件下測(cè)定并比較野生型與突變型Sortase A酶催化連接產(chǎn)物形成的速率。結(jié)果顯示，突變型酶具有高催化活性，連接體系中連接產(chǎn)物迅速積累：底物與酶一經(jīng)混合立即取樣便可檢出連接產(chǎn)物 (圖8，泳道7)，至30 min時(shí)反應(yīng)已超過(guò)60%，至120 min反應(yīng)接近完成 (圖8，泳道9，12；圖9)。與之相比，野生型酶的活性則低得多，反應(yīng)至60 min，連接產(chǎn)物尚不明顯，至120 min反應(yīng)僅完成20%左右 (圖8，泳道1–6；圖9)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確證Chen等報(bào)道的突變型Sortase A酶的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)較野生型酶大幅提升，可使連接反應(yīng)在1–2 h接近完成。

圖8 SDS-PAGE比較野生型與突變型Sortase A催化的蛋白質(zhì)連接效率Fig. 8 SDS-PAGE assay comparing ligation efficiency mediated by wildtype and mutant Sortase A. 1–6: wildtype Sortase A mediated ligation between GFP-LPETG and GGGYK-Biotin, with 0, 10, 30, 60, 90, 120 minutes of reaction respectively; 7–12: mutant Sortase A mediated ligation between GFP-LPETG and GGGYK-Biotin, with 0, 10, 30, 60, 90, 120 minutes of reaction respectively (: substrate GFP-LPETG;: ligation product GFP-LPETGGGYK-Biotin;: wildtype or mutant Sortase A).

圖9 野生型與突變型Sortase A的連接效率比較Fig. 9 Comparison of ligation efficiency mediated by wild type and mutant Sortase A.

3 討論

Sortase A酶催化的蛋白質(zhì)連接反應(yīng)，因其反應(yīng)條件溫和、特異性強(qiáng)，已在生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[21]，但天然Sortase A酶催化的連接反應(yīng)效率較低，影響了它的廣泛應(yīng)用。正因如此，基于Sortase A酶催化特性的定向分子改造已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)，較成功的例子有，近期David Liu和Dirk Schwarzer實(shí)驗(yàn)室分別在提高酶催化活性及改變底物識(shí)別特征等方面取得進(jìn)展[25–26]，有趣的是，篩選得到的關(guān)鍵突變都發(fā)生在底物結(jié)合區(qū)域附近。這些報(bào)道顯示出Sortase A酶具有廣闊的改造潛力，同時(shí)也啟示，對(duì)Sortase A酶的改造重點(diǎn)應(yīng)聚焦于底物結(jié)合區(qū)域附近的位點(diǎn)上，通過(guò)飽和突變方法輔以系統(tǒng)篩選是比較可行的方案。目前用于檢驗(yàn)Sortase A酶突變體催化活性的分析技術(shù)，過(guò)程復(fù)雜且需特殊設(shè)備，成為對(duì)突變體活性進(jìn)行系統(tǒng)鑒定分選的主要制約因素，因此迫切需要建立一種簡(jiǎn)單靈敏的用于監(jiān)測(cè)連接反應(yīng)進(jìn)程的方法。

為此，本研究設(shè)計(jì)了由GFP-LPETG蛋白和GGGYK-Biotin短肽組成的新型報(bào)道底物，并利用重組基因工程技術(shù)，成功制備GFP-LPETG蛋白，野生型Sortase A酶及Irwin Chen等報(bào)道的高活性突變酶。以GFP-LPETG及GGGYKBiotin為底物建立連接體系，并應(yīng)用于野生型及高活性突變型Sortase A酶催化的連接反應(yīng)，以證實(shí)該檢測(cè)系統(tǒng)的可靠性。最初在底物中引入生物素分子，是希望通過(guò)鏈霉親和素分子印跡法來(lái)實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)連接產(chǎn)物的生成；出乎意料的是，GGGYK-Biotin雖與GGGYK僅相差一個(gè)生物素分子(226 Da)，但連接產(chǎn)物的電泳遷移率相比底物GFP-LPETG卻產(chǎn)生明顯的降低，使得連接反應(yīng)進(jìn)程可直接通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳法精確測(cè)定。對(duì)此現(xiàn)象的一種解釋是，連接產(chǎn)物中的Biotin分子側(cè)鏈具有剛性構(gòu)象，造成連接產(chǎn)物在SDS-PAGE電泳過(guò)程中受阻，致其電泳遷移率與分子量不再呈線(xiàn)性對(duì)應(yīng)關(guān)系。連接反應(yīng)分析步驟的大大簡(jiǎn)化，將顯著促進(jìn)后續(xù)突變體篩選規(guī)模的擴(kuò)大。在實(shí)際篩選過(guò)程中，尚需對(duì)SDS-PAGE凝膠電泳法初步篩選出的陽(yáng)性樣本作進(jìn)一步驗(yàn)證，預(yù)期初篩之后的陽(yáng)性樣本數(shù)目將大大減少，可以采用最初設(shè)計(jì)的鏈霉親和素分子印跡法獨(dú)立確證連接產(chǎn)物的生成效率。

在本研究建立的連接體系下，分析比較野生型與突變型酶的催化效率，證實(shí)Irwin Chen等報(bào)道的高活性突變酶具有野生酶無(wú)法比擬的高催化效率，連接反應(yīng)可以在2 h左右趨近完成，這在以往的連接反應(yīng)中是不可能實(shí)現(xiàn)的?？紤]到很多蛋白質(zhì)在較高溫度 (如37 ℃) 下不穩(wěn)定，盡可能縮短反應(yīng)時(shí)間對(duì)很多活性物質(zhì)至關(guān)重要。對(duì)比傳統(tǒng)化學(xué)連接反應(yīng)制備過(guò)程繁瑣、產(chǎn)物不均一以及反應(yīng)耗時(shí)長(zhǎng)等缺陷，此突變型酶催化的連接反應(yīng)展現(xiàn)了明顯優(yōu)勢(shì)。在本研究基礎(chǔ)上，高活性突變酶已被成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)的固定化及大分子量蛋白質(zhì)的NMR核磁結(jié)構(gòu)測(cè)定過(guò)程中 (待發(fā)表)。

綜上所述，本研究成功開(kāi)發(fā)一種新型的連接反應(yīng)報(bào)道系統(tǒng)，具有簡(jiǎn)單快速靈敏的特點(diǎn)，可應(yīng)用于大規(guī)模篩選，為后續(xù)進(jìn)一步定向優(yōu)化Sortase A酶提供了通用簡(jiǎn)易的篩選鑒定方法。同時(shí)，成功制備了一種已報(bào)道的高活性突變型Sortase A酶，可廣泛應(yīng)用于各種高效蛋白質(zhì)連接過(guò)程。

REFERENCES

[1] Hackenberger CP, Schwarzer D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew Chem Int Ed Engl, 2008, 47(52): 10030–10074.

[2] Song LP, Huang H. Protein splicing and its application. Chin J Bitotech, 2003, 19(2): 249–254 (in Chinese).宋利萍, 黃華. 蛋白質(zhì)剪接及其應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2003, 19(2): 249–254.

[3] Luo LX, Shi ZM. Sortase: new target enzyme in Gram-positive pathogens. Prog Biochem Biophys, 2006, 33(9): 828–833 (in Chinese).羅立新, 施周銘. 一種抗革蘭氏陽(yáng)性致病菌新型靶酶—分選酶. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2006, 33(9): 828–833.

[4] Mazmanian SK, Liu G, Ton-That H, et al. Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall. Science, 1999, 285(5428): 760–763.

[5] Necchi F, Nardi-Dei V, Biagini M, et al. Sortase A substrate specificity in GBS pilus 2a cell wall anchoring. PLoS ONE, 2011, 6(10): e25300.

[6] Kang HJ, Baker EN. Structure and assembly of Gram-positive bacterial pili: unique covalent polymers. Curr Opin Struct Biol, 2012, 22(2): 200–207.

[7] Spirig T, Weiner EM, Clubb RT. Sortase enzymes in Gram-positive bacteria. Mol Microbiol, 2011, 82(5): 1044–1059.

[8] Mazmanian SK, Ton-That H, Schneewind O. Sortase-catalysed anchoring of surface proteins to the cell wall of Staphylococcus aureus. Mol Microbiol, 2001, 40(5): 1049–1057.

[9] Ton-That H, Liu G, Mazmanian SK, et al. Purification and characterization of sortase, the transpeptidase that cleaves surface proteins of Staphylococcus aureus at the LPXTG motif. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(22): 12424–12429.

[10] Huang X, Aulabaugh A, Ding W, et al. Kinetic mechanism of Staphylococcus aureus sortase SrtA.Biochemistry, 2003, 42(38): 11307–11315.

[11] Zong Y, Bice TW, Ton-That H, et al. Crystal structures of Staphylococcus aureus sortase A and its substrate complex. J Biol Chem, 2004, 279(30): 31383–31389.

[12] Race PR, Bentley ML, Melvin JA, et al. Crystal structure of Streptococcus pyogenes sortase A: implications for sortase mechanism. J Biol Chem, 2009, 284(11): 6924–6933.

[13] Ilangovan U, Ton-That H, Iwahara J, et al. Structure of sortase, the transpeptidase that anchors proteins to the cell wall of Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(11): 6056–6061.

[14] Frankel BA, Kruger RG, Robinson DE, et al. Staphylococcus aureus sortase transpeptidase SrtA: insight into the kinetic mechanism and evidence for a reverse protonation catalytic mechanism. Biochemistry, 2005, 44(33): 11188–11200.

[15] Suree N, Liew CK, Villareal VA, et al. The structure of the Staphylococcus aureus sortase-substrate complex reveals how the universally conserved LPXTG sorting signal is recognized. J Biol Chem, 2009, 284(36): 24465–24477.

[16] Kruger RG, Otvos B, Frankel BA, et al. Analysis of the substrate specificity of the Staphylococcus aureus sortase transpeptidase SrtA. Biochemistry, 2004, 43(6): 1541–1551.

[17] Bentley ML, Lamb EC, McCafferty DG. Mutagenesis studies of substrate recognition and catalysis in the sortase A transpeptidase from Staphylococcus aureus. J Biol Chem, 2008, 283(21): 14762–14771.

[18] Tian BX, Eriksson LA. Catalytic mechanism and roles of Arg197 and Thr183 in the Staphylococcus aureus sortase A enzyme. J Phys Chem B, 2011, 115(44): 13003–13011.

[19] Naik MT, Suree N, Ilangovan U, et al. Staphylococcus aureus Sortase A transpeptidase. Calcium promotes sorting signal binding by altering the mobility and structure of an active site loop. J Biol Chem, 2006, 281(3): 1817–1826.

[20] Hirakawa H, Ishikawa S, Nagamune T. Design of Ca2+-independent Staphylococcus aureus sortase A mutants. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(12): 2955–2961.

[21] Dasgupta S, Samantaray S, Sahal D, et al. Isopeptide ligation catalyzed by quintessential sortase A: mechanistic cues from cyclic and branched oligomers of indolicidin. J Biol Chem, 2011, 286(27): 23996–24006.

[22] Liew CK, Smith BT, Pilpa R, et al. Localization and mutagenesis of the sorting signal binding site on sortase A from Staphylococcus aureus. FEBS Lett, 2004, 571(1/3): 221–226.

[23] Frankel BA, Tong Y, Bentley ML, et al. Mutational analysis of active site residues in the Staphylococcus aureus transpeptidase SrtA. Biochemistry, 2007, 46(24): 7269–7278.

[24] Nobbs AH, Vajna RM, Johnson JR, et al. Consequences of a sortase A mutation in Streptococcus gordonii. Microbiology, 2007, 153(Pt 12): 4088–4097.

[25] Chen I, Dorr BM, Liu DR. A general strategy for the evolution of bond-forming enzymes using yeast display. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(28): 11399–11404.

[26] Piotukh K, Geltinger B, Heinrich N, et al. Directed evolution of sortase A mutants with altered substrate selectivity profiles. J Am Chem Soc, 2011, 133(44): 17536–17539.

[27] Ton-That H, Mazmanian SK, Faul KF, et al. Anchoring of surface proteins to the cell wall of Staphylococcus aureus. Sortase catalyzed in vitro transpeptidation reaction using LPXTG peptide and NH(2)-Gly(3) substrates. J Biol Chem, 2000, 275(13): 9876–9881.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

A novel reporter system monitoring Sortase A catalyzed protein ligation efficiency

Jian Li1,2, Pengju Wang1,2, Yunfeng Cui2, Peijian Zou2, and Gang Qin2
1 College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China 2 National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Efforts on directed evolution of sortase A to optimize its catalytic properties have been undertaken and shown the promise. To facilitate screening of sortase A mutants with expected catalytic properties, a novel ligation efficiency monitoring system, including reporter substrates GFP-LPETG and GGGYK-Biotin, was developed. GFP-LPETG, wild type sortase A, and a recently reported high activity sortase A mutant were prepared recombinantly from Escherichia coli BL21 (DE3). Taking advantage of the newly designed reporter system, the ligation efficiency catalyzed by wild type and mutant form of sortase A could be sensitively monitored via SDS-PAGE directly. Consistent with previous report, the mutant sortase A displayed much higher catalytic activity compared to wild type enzyme, indicating the new reporter system is easily and fast handled and sensitive. The application of this reporter system into systemic screening will facilitate future directed optimization of sortase A.

sortase A, protein ligation efficency, reporter substrates, GFP-LPETG, GGGYK-Biotin, high activity mutant

April 21, 2013; Accepted: July 29, 2013

Peijian Zou. Tel/Fax: +86-22-24828722; E-mail: zou_pj@tib.cas.cn Gang Qin. Tel/Fax: +86-22-24828722; E-mail: qin_g@tib.cas.cn

李健, 王鵬舉, 崔云鳳, 等. 檢測(cè)Sortase A酶催化蛋白質(zhì)連接效率的新型報(bào)道系統(tǒng). 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(2): 284-293.

Li J, Wang PJ, Cui YF, et al. A novel reporter system monitoring Sortase A catalyzed protein ligation efficiency. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 284-293.

Supported by: Program of “One Hundred Talented People” of the Chinese Academy of Sciences (No. KSCW2-YW-BR-4), Tianjin Municipal Science & Technology Project (No. 11ZCZDSY08100).

中國(guó)科學(xué)院百人計(jì)劃項(xiàng)目 (No. KSCW2-YW-BR-4), 天津科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 11ZCZDSY08100) 資助。