張巖，胡永浩，楊帆，鄭海學(xué) 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 口蹄疫國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046

口蹄疫病毒外源序列插入位點(diǎn)的研究進(jìn)展

張巖1，胡永浩1，楊帆2，鄭海學(xué)2
1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 口蹄疫國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046

伴隨著對(duì)口蹄疫病毒 (FMDV) 蛋白結(jié)構(gòu)功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)FMDV能夠表達(dá)外源基因片段。通過(guò)對(duì)FMDV的基因進(jìn)行改造和修飾研究，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了不同應(yīng)用目的，如提高病毒滴度、引入標(biāo)記、提高免疫應(yīng)答、降低致病性等。文中主要從FMDV接受外源基因插入位點(diǎn)角度來(lái)介紹現(xiàn)階段關(guān)于FMDV表達(dá)外源基因相關(guān)進(jìn)展。

口蹄疫病毒，外源基因，插入位點(diǎn)

口蹄疫 (Foot and mouth disease，F(xiàn)MD) 是由口蹄疫病毒 (Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV) 引起的一種高度傳染性疾病，主要感染偶蹄動(dòng)物 (主要是牛、豬和羊等)。不僅對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也對(duì)畜產(chǎn)品的國(guó)際貿(mào)易帶來(lái)巨大的負(fù)面影響[1-2]。

FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，有7種血清型，包括A、O、C、Asia 1和SAT 1、2和3。FMDV基因組為單股正鏈RNA，病毒基因組由8 500個(gè)堿基左右組成，RNA被衣殼包裹，其正二十面體衣殼由4種結(jié)構(gòu)蛋白VP1-VP4各60 份拷貝構(gòu)成。FMDV翻譯成1個(gè)多聚蛋白，該多聚蛋白被蛋白酶裂解成結(jié)構(gòu)蛋白 (VP1、VP2、VP3和VP4) 和非結(jié)構(gòu)蛋白 (L、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3Dpol)[2]。目前反向遺傳學(xué)技術(shù)在FMDV研究中應(yīng)用廣泛，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者利用反向遺傳學(xué)在FMDV基因組上插入外源基因的方法來(lái)研究FMDV的復(fù)制和感染過(guò)程，并在這一方面取得了較大的進(jìn)展。

在病毒上引入標(biāo)記，然后檢測(cè)標(biāo)記來(lái)確定病毒不同時(shí)期的狀態(tài)是研究病毒中常用的方法，同時(shí)也有在病毒上引入外源基因?qū)⒉《咀鳛檩d體用于應(yīng)用研究。因此病毒能夠接受外源基因插入的位點(diǎn)是首要解決的問(wèn)題。接下來(lái)我們從現(xiàn)階段FMDV能夠表達(dá)外源基因的區(qū)域來(lái)進(jìn)行詳細(xì)介紹。

1 前導(dǎo)蛋白L區(qū)引入外源基因片段

FMDV的前導(dǎo)蛋白L蛋白具有木瓜樣蛋白酶特性。FMDV可以識(shí)別兩種密碼子，因而具有兩種編碼產(chǎn)物L(fēng)ab和Lb。兩種形式的蛋白酶均能夠降解宿主細(xì)胞的翻譯起始因子eIF4G，從而抑制宿主“帽子”依賴性的mRNA翻譯，導(dǎo)致宿主表達(dá)干擾素的水平降低，進(jìn)而抑制宿主免疫應(yīng)答[3]。由于L蛋白在FMDV逃避宿主免疫方面的特性，L蛋白對(duì)于FMDV的重要性不言而喻。1995年P(guān)iccone等[4]發(fā)現(xiàn)FMDV L蛋白的基因在病毒復(fù)制過(guò)程中并不是完全必需的，當(dāng)保留了編碼L蛋白序列Lab和Lb的AUG之間的84 nt堿基就能保持病毒的活性。在1996年Brown等[5]在研究L蛋白缺失FMDV毒力時(shí)，通過(guò)感染牛發(fā)現(xiàn)L蛋白缺失的病毒致病性相比原毒有所下降。Piccone等[6]在2010年成功拯救出3株含有外源片段的L蛋白缺失重組FMDV，后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了L蛋白在參與感染過(guò)程的重要性。2011年P(guān)iccone等[7]在L蛋白的Lab和Lb之間引入了一個(gè)含有酶切位點(diǎn)的氨基酸序列，然后在該位點(diǎn)依次引入流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)、Flag和TC標(biāo)簽，構(gòu)建了3株重組病毒 (圖1)。在成功拯救出病毒后，在細(xì)胞水平檢測(cè)到了重組病毒中外源片段的表達(dá)。這證明了編碼L的蛋白區(qū)域具有攜帶和表達(dá)外源片段的能力。對(duì)L區(qū)進(jìn)行反向遺傳操作也是降低致病性提高生物安全性的重要途徑，作者研究團(tuán)隊(duì)利用突變L基因抑制天然免疫的功能性位點(diǎn)，獲得了對(duì)宿主動(dòng)物無(wú)致病性、不排毒以及免疫應(yīng)答快的重組FMDV。

圖1 FMDV全基因及構(gòu)建質(zhì)粒簡(jiǎn)圖[7]Fig. 1 Schematic diagram of the FMDV genome and plasmids used in this study[7].

2 VP1區(qū)引入外源基因

FMDV的VP1表面存在一個(gè)被高度保守的Arg-Gly-Asp (RGD) 修飾的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠被細(xì)胞表面的αν整聯(lián)蛋白的家族受體 (ανβ1、ανβ3、ανβ6和ανβ8)所識(shí)別[8-11]。研究表明多種血清型的FMDV VP1的G-H環(huán)結(jié)構(gòu)同時(shí)也是一個(gè)抗原位點(diǎn)[9,12-13]。VP1的G-H環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以利用胰蛋白酶水解的方法除去，在除去VP1的G-H環(huán)結(jié)構(gòu)后導(dǎo)致FMDV的毒力下降了許多[13-14]。

2012年Wang等[15]在研究VP1的G-H環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)FMDV復(fù)制的影響時(shí)，在Asia 1型FMDV上G-H環(huán)狀結(jié)構(gòu)中插入了O型FMDV的保護(hù)性中和表位，獲得的重組病毒具有誘導(dǎo)產(chǎn)生兩種血清型中和抗體的能力。同年Lawrence等[16]在VP1的G-H環(huán)結(jié)構(gòu)上成功插入了一個(gè)Flag標(biāo)簽(DYKDDDDK)。因?yàn)镚-H環(huán)是一個(gè)柔性的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，為了最小限度地影響VP1的空間構(gòu)型，Lawrence對(duì)插入Flag的序列進(jìn)行了調(diào)整，將DKYDDDDK替換成DYKDDDDK。蝕斑實(shí)驗(yàn)表明VP1插入標(biāo)簽后FMDV的毒力下降。通過(guò)免疫熒光反應(yīng)，檢測(cè)到Flag和VP1的表達(dá)。

Seago等[17]在2012年研究VP1 G-H環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變對(duì)FMDV特性影響時(shí)，在RGD下游即VP1的155–156位氨基酸中插入了HA和Flag標(biāo)簽。含有標(biāo)簽的重組病毒可以利用主要的整連蛋白受體，重組病毒的蝕斑與親本病毒相似，但毒力也存在一定程度的下降。VP1的G-H環(huán)狀結(jié)構(gòu)的上游和下游均存在插入位點(diǎn)，用于表達(dá)外源片段。由于G-H環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)FMDV比較重要，可能影響到病毒抗原性和吸附能力，所以此區(qū)域能接受外源片段的大小值得探索。

3 VP1區(qū)與2A蛋白區(qū)之間引入外源基因

FMDV的2A蛋白具有自我剪切功能。在FMDV復(fù)制的過(guò)程中，2A蛋白從C端開(kāi)始將大部分的衣殼蛋白從非結(jié)構(gòu)蛋白上切下，再由3C蛋白酶進(jìn)一步對(duì)多聚蛋白進(jìn)行水解。鑒于2A的特性，有學(xué)者一直嘗試?yán)眠@種特性在此位置進(jìn)行反向遺傳操作。

2013年Seago等[18]在VP1區(qū)末端2A蛋白前，插入了大分子的標(biāo)記熒光蛋白。其構(gòu)建了2株重組病毒引入720 nt的綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 和933 nt的海腎熒光素酶 (Renilla luciferase，RL)。Seago等實(shí)驗(yàn)的最初目的是在此區(qū)域表達(dá)GFP和RL，但是重組病毒感染山羊上皮細(xì)胞的結(jié)果顯示，3代以后細(xì)胞就不再出現(xiàn)病變了，也無(wú)法通過(guò)共聚焦觀察到GFP和RL的熒光。為了進(jìn)一步研究此區(qū)域能接受外源基因的大小，Seago等在原位點(diǎn)處插入了外源片段構(gòu)建了6株重組病毒 (外源片段大小依次為105 nt、204 nt、303 nt、417 nt、504 nt和609 nt)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示插入外源片段小于300 nt的病毒能夠穩(wěn)定傳代并能從中檢測(cè)到插入基因，蝕斑實(shí)驗(yàn)也顯示出了與親本病毒相近的毒力。這說(shuō)明在此VP1末端和2A蛋白區(qū)之間，F(xiàn)MDV能夠容納較大的外源片段，這對(duì)FMD研究是一個(gè)新的突破。

4 3A蛋白區(qū)引入外源基因

FMDV與其他小RNA病毒不同，它有更長(zhǎng)的3A蛋白。研究發(fā)現(xiàn)3A蛋白是使用物理方法與細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合，但在FMDV感染細(xì)胞和復(fù)制的過(guò)程中3A非結(jié)構(gòu)蛋白的功能并沒(méi)有被很好認(rèn)識(shí)[19-20]。然而在3A蛋白發(fā)生變化時(shí)，這些變化都會(huì)導(dǎo)致宿主的特異性、適應(yīng)性或毒力發(fā)生改變[21-23]。如Taiwan97毒株是因?yàn)?A92-102位氨基酸缺失導(dǎo)致對(duì)牛的致病性下降。2012年Li等[24]用Flag標(biāo)簽和編碼單純性皰疹病毒 (HSV) D蛋白的抗原表位 (QPELAPEDPED)，替換了3A中第92～102位氨基酸，并且成功拯救出兩株重組口蹄疫病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組病毒的毒力和復(fù)制動(dòng)力學(xué)與原毒相近。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在口蹄疫病毒3A處替換的FLAG與HSV抗原表位都能夠持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)。

5 3B蛋白區(qū)引入外源基因

FMDV具有3個(gè)相似但不完全相同的3B蛋白 (3B1-3) 或VPg (VPg1-3)，長(zhǎng)度在23–24個(gè)氨基酸左右。FMDV 3B蛋白對(duì)病毒感染力影響不大，但分離的野毒都完整地保留了3B結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)有可能與FMDV進(jìn)化過(guò)程中選擇壓力有密切關(guān)系[25]。也有實(shí)驗(yàn)證明3B3是FMDV 3Dpol最有效的底物[26]。Falk和Pacheco[27-28]的研究表明，當(dāng)FMDV存在3B3時(shí)才具有感染性，若僅有3B1或3B2則會(huì)導(dǎo)致病毒失活。2010年Arias等[29]在研究3B的缺失與突變與細(xì)胞病變關(guān)系時(shí)，構(gòu)建了4株僅有單一3B拷貝的重組病毒，其中還包含2株由3B1和3B2重組的嵌合病毒 (圖2)。結(jié)果顯示不含3B3結(jié)構(gòu)以及未保留3B3末端9 位氨基酸的2株重組病毒無(wú)法穩(wěn)定復(fù)制。這個(gè)實(shí)驗(yàn)精確定位了3B3結(jié)構(gòu)中對(duì)于FMDV復(fù)制有影響的氨基酸，從而證明3B3結(jié)構(gòu)對(duì)于FMDV復(fù)制的重要性。

2010年P(guān)acheco等[30]在研究3B與FMDV培養(yǎng)特性和對(duì)牛的致病性實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了5株重組病毒。其中3株是在3B1、3B2和3B3分別隨機(jī)地插入了19個(gè)氨基酸的序列，另外2株在保留了3B3后刪除了部分序列。5株重組病毒均拯救成功，然后對(duì)其毒力、復(fù)制能力以及各項(xiàng)生物學(xué)特性進(jìn)行了檢測(cè)，最后與親本病毒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)重組病毒的各項(xiàng)生物指標(biāo)與親本病毒基本保持一致。2012年Uddowla等[31]在研究FMD負(fù)標(biāo)記疫苗的時(shí)候，對(duì)FMDV全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)行了多點(diǎn)突變和片段的缺失。其中包含在3B2的部分氨基酸進(jìn)行缺失后替換，構(gòu)建了多株重組病毒，并且成功拯救出了構(gòu)建的FMDV。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的重組病毒并沒(méi)有產(chǎn)生穩(wěn)定的中和抗體，同時(shí)誘導(dǎo)的抗體沒(méi)有產(chǎn)生預(yù)期的交叉保護(hù)現(xiàn)象，但不同毒株誘導(dǎo)的抗體可以區(qū)分。

圖2 嵌合VPg的構(gòu)建簡(jiǎn)圖[27]Fig. 2 Schematic representation of the constructions with one copy of VPgs[27].

鑒于3B的特殊結(jié)構(gòu)，這一區(qū)域一直是FMDV反向遺傳操作的區(qū)域。該區(qū)域作為FMDV載體的插入位點(diǎn)是值得深入研究的。作者所在團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)行3B不同位置插入大片段基因的研究，如果突破將進(jìn)一步推進(jìn)FMDV表達(dá)插入基因大小的問(wèn)題。

6 展望

FMDV基因序列上存在多個(gè)位點(diǎn)可以穩(wěn)定表達(dá)插入的外源基因，在利用反向遺傳學(xué)進(jìn)行操作時(shí)，病毒的可控性很高。FMDV感染細(xì)胞時(shí)細(xì)胞病變快，復(fù)制滴度高，使得FMDV能夠高效表達(dá)外源基因。這兩點(diǎn)說(shuō)明FMDV具有病毒載體的潛質(zhì)。但FMD作為病毒載體面臨兩個(gè)問(wèn)題：第一是毒株的安全性；第二是病毒能夠表達(dá)外源基因的大小。這兩點(diǎn)限制了口蹄疫病毒作為病毒載體的應(yīng)用。

FMDV容易變異，這對(duì)FMD的防控十分不利，所以要將FMDV作為載體，穩(wěn)定的弱毒株是關(guān)鍵。目前許多學(xué)者都在嘗試將FMDV弱化，不僅能夠作為載體，如果毒株穩(wěn)定性強(qiáng)可以直接制成弱毒苗疫苗。致弱的FMDV載體是未來(lái)研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向。有研究通過(guò)對(duì)病毒基因組進(jìn)行改造在保證其活性的前提下降低其毒力，如L蛋白的SAP結(jié)構(gòu)突變毒株，發(fā)現(xiàn)感染動(dòng)物后無(wú)臨床癥狀也沒(méi)有排毒帶毒現(xiàn)象，并能產(chǎn)生有保護(hù)性的抗體[3,32-33]。目前我們實(shí)驗(yàn)室利用反向遺傳技術(shù)已經(jīng)成功構(gòu)建了病毒滴度高、抗原匹配性好、免疫保護(hù)力強(qiáng)的疫苗株[34]。目前現(xiàn)階段有關(guān)FMDV表達(dá)外源基因的報(bào)道大都是小片段標(biāo)記。Seago等[18]的研究為FMDV表達(dá)大的外源片段方面帶來(lái)了新的突破，但現(xiàn)階段關(guān)于FMDV作為載體插入大片段仍不成熟，尚不能在技術(shù)水平達(dá)到其他病毒載體的水平 (如：如腺病毒、桿狀病毒和痘病毒等)。因此FMDV基因組承載外源片段的能力也是FMDV研究的又一重點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)外一直致力于FMDV的研究，旨在有效控制FMD的流行。通過(guò)引入外源基因?qū)MDV進(jìn)行改造可以解決很多現(xiàn)階段FMD防控的問(wèn)題。如：我國(guó)控制FMD的主要手段是通過(guò)免疫滅活疫苗，由于在實(shí)際防控中FMD疫苗的多次免疫會(huì)造成感染抗體與疫苗免疫抗體難以區(qū)分的問(wèn)題。我們?cè)贔MDV基因組引入標(biāo)記，然后配套相關(guān)標(biāo)記檢測(cè)試劑，在理論上是完全可以鑒別野毒感染抗體和免疫抗體。未來(lái)可以在FMDV中引入一些免疫因子的基因，如：樹(shù)突狀刺激因子的基因，這能改善免疫原性提高免疫效果。還借助FMDV的復(fù)制滴度高，在FMDV上引入外源基因進(jìn)行高效表達(dá)。在FMD疫苗株上導(dǎo)入其他病原的主要抗原基因生產(chǎn)出雙價(jià)苗，能達(dá)到一苗防兩病的效果，同時(shí)簡(jiǎn)化養(yǎng)殖場(chǎng)的免疫程序。

FMDV插入外源基因的研究是十分具有潛力的，無(wú)論是應(yīng)用研究還是基礎(chǔ)研究都能使用到相關(guān)技術(shù)，這為FMDV研究提供了一個(gè)新思路。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress in insertion sites for foreign sequence of foot and mouth disease virus

Yan Zhang1, Yonghao Hu1, Fan Yang2, and Haixue Zheng2
1 College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China 2 National Foot and Mouth Disease Reference Laboratory, State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, Gansu, China

With the progess in studying gene structure and function of foot and mouth disease virus (FMDV), FMDV canexpress exogenous genes in different sites. Through transforming and modifying FMDV can achieve different application purposes such as improving virus titer, introducing tag, improving immune responses, and reducing pathogenicity. From the perspective of FMDV receiving inserted exogenous gene, this paper mainly describes the latest relevant developments of FMDV’s expression to exogenous gene.

foot and mouth disease virus, exogenous gene, insertion site

May 2, 2013; Accepted: July 16, 2013

Yonghao Hu. Tel/Fax: +86-931-7631220; E-mail: yhh0817@126.com Haixue Zheng. Tel/Fax: +86-931-8342086; E-mail: haixuezheng@163.com

張巖, 胡永浩, 楊帆, 等. 口蹄疫病毒外源序列插入位點(diǎn)的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(2): 175-181.

ZhangY, Hu YH, Yang F, et al. Progress in insertion sites for foreign sequence of foot and mouth disease virus. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 175-181.

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA10A211-1), the High-level Technological Talent Program of Gansu Province (No. 1013JHTA008), the International Atomic Energy Agency (No. 16025/R0), China Agriculture Research System (No. CARS-39).

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2011AA10A211-1)，甘肅省高層次人才科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)扶持行動(dòng)項(xiàng)目 (No. 1013JHTA008)，

國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)項(xiàng)目 (No. 16025/R0)，中國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系 (No. CARS-39) 資助。

時(shí)間: 2013-08-16 網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130816.1711.002.html