李東霞，黎 明，王洪鑫，王舒雅，路福平天津科技大學生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 國家工業(yè)酶工程實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457

綜述

生物法合成戊二胺研究進展

李東霞，黎 明，王洪鑫，王舒雅，路福平
天津科技大學生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 國家工業(yè)酶工程實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457

隨著經濟快速發(fā)展，大氣污染和全球變暖的趨勢日益惡化。世界上每年消耗大量石化資源來源的聚酰胺，戊二胺作為聚酰胺的重要組成單體，生物法合成戊二胺具有經濟學和生態(tài)學雙重意義。目前, 生物法合成戊二胺的工程菌主要有谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌，文中從微生物中戊二胺的代謝、戊二胺合成途徑的關鍵酶和轉運蛋白、戊二胺生產最佳代謝途徑和戊二胺產量的預測、代謝工程研究進展等方面綜述了生物法合成戊二胺的最新研究現(xiàn)狀和進展，并對其前景進行了展望。

戊二胺，谷氨酸棒狀桿菌，大腸桿菌，賴氨酸脫羧酶，尸胺轉運蛋白

戊二胺(Diaminopentane)，又名尸胺(Cadaverine)、1,5-二氨基戊烷、五亞甲基二胺或尸毒素，是生物胺類 (包括腐胺、精胺、亞精胺和尸胺等) 中的一種[1]。1885年，德國柏林的醫(yī)師Ludwig Brieger 在腐敗的尸體中首次發(fā)現(xiàn)該胺類，并以此得名尸胺[2]。在細胞內，戊二胺是賴氨酸合成途徑的延伸反應產物，是賴氨酸脫羧酶(E.C.4.1.1.18)催化賴氨酸脫羧產生的 (圖1)。戊二胺具有許多重要的生理功能，如戊二胺是微生物細胞內調節(jié)鐵離子濃度的“鐵親和系統(tǒng)”和一些嚴格厭氧的革蘭氏陰性菌肽聚糖的主要組成成分[3-5]；戊二胺在關閉孔蛋白通道和保護大腸桿菌免受氧的毒害方面也起著重要的作用[6-8]；內源性戊二胺的分泌以及胞內高濃度戊二胺積累可導致外膜滲透性降低，抑制某些抗生素如頭孢霉素類抗生素的作用[9-11]。

戊二胺在農業(yè)、醫(yī)學和工業(yè)上具有廣泛的應用。在農業(yè)上，外源施加戊二胺可以改善坐果和促進果實發(fā)育，提高果實的產量[12-13]；在醫(yī)學上，它也可作為一種有效治療痢疾的藥物[14]；在工業(yè)上，戊二胺與二元酸進行聚合反應可合成優(yōu)質高分子材料——新型尼龍[15]。

圖1 賴氨酸脫羧反應Fig. 1 Reaction of lysine decarboxylate.

每年全球約生產600萬t聚酰胺，其中尼龍6.6 (即聚酰胺6.6, Polyamide 6.6, PA 6.6) 是聚酰胺類產品中開發(fā)最早、產量最大、應用最廣的產品之一，被廣泛應用于航空航天、汽車部件、機械零部件、電子電器和包裝材料領域中，在膠粘劑及化妝品領域也得到了廣泛應用[16]。尼龍6.6是由己二酸和己二胺按摩爾比1：1聚合的產物。目前，己二酸可利用生物催化技術合成，但己二胺的合成仍然依賴于石油化工產品[17]。隨著國際油價的飆升和石油資源的枯竭以及石油資源的大量消耗導致大氣CO2含量的迅速升高和環(huán)境污染，人們試圖尋找一種能利用生物方法生產己二胺的替代物，從而用一種可再生資源替代石油來生產尼龍[18]。戊二胺是賴氨酸脫羧的產物，與己二胺互為同系物，可代替己二胺用來合成新型尼龍 (圖2)。在工業(yè)上，戊二胺可以分別與己二酸、琥珀酸和癸二酸等二元酸聚合形成新型材料聚酰胺5.6(Polyamide 5.6，PA 5.6)、聚酰胺5.4[19-21]和聚酰胺5.10[22]。PA 5.6具有重要的工業(yè)用途，與PA 6.6一樣具有良好的機械強度、較高的熔點和耐各種有機溶劑的特性，可以替代PA 6.6使用[23]。聚酰胺5.10材料性能極佳，具有高熔點(215 ℃)、低吸水率(1.8%)、低密度(1.07 g/cm3)等優(yōu)點。由于己二酸、琥珀酸已經可以通過微生物合成，癸二酸也可以從蓖麻油來制取。因此，戊二胺的生物合成成為合成新型材料聚酰胺的一個關鍵問題，下文將闡述生物法合成戊二胺的最新研究進展。

圖2 PA 5.6反應方程式Fig. 2 Chemical structure and production of polyamide 5.6 using cadaverine and adipic acid from renewable resources.

1 微生物中戊二胺的代謝

微生物中戊二胺的代謝包括戊二胺的合成、降解、吸收和分泌。微生物中存在兩種完全不同的賴氨酸合成途徑：一種是始于α-酮戊二酸和乙酰-CoA的α-氨基己二酸途徑 (AAA)，另一種是始于天冬氨酸的二氨基庚二酸途徑 (DAP)。第一種途徑主要存在于高等真菌和古生菌中，某些細菌如嗜熱棲熱菌屬中也存在該途徑；第二種途徑主要存在于細菌和植物中，而且這兩個途徑沒有直接的進化關系[24]。

1.1 大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中戊二胺的代謝途徑

戊二胺是通過賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧形成的。大腸桿菌能夠直接合成戊二胺，谷氨酸棒狀桿菌雖然不能直接合成戊二胺，但它能高效合成戊二胺的前體，即賴氨酸脫羧酶的底物賴氨酸，并且二者合成賴氨酸的途徑類似 (圖3)[25]。如果在谷氨酸棒狀桿菌中表達賴氨酸脫羧酶，谷氨酸棒桿菌也能像大腸桿菌一樣直接合成戊二胺[26]。大腸桿菌中賴氨酸的合成途徑從TCA循環(huán)的中間代謝物草酰乙酸(Oxaloacetate)開始，需要連續(xù)十步的酶反應。前3步生成代謝的節(jié)點中間物天冬氨酸半醛(Aspartic acid semialdehyde)，由它進一步合成L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-賴氨酸。L-賴氨酸經賴氨酸脫羧酶的催化脫羧生成戊二胺。在大腸桿菌中，存在3種天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)：LysC、ThrA和MetL，它們是催化天冬氨酸磷酸化成天冬氨酰磷酸的同工酶。

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其中天冬氨酸激酶Ⅰ(ThrA)[27]、天冬氨酸激酶Ⅱ(MetL)[28]是雙功能酶，它們同時也具有高絲氨酸脫氫酶活性，能催化分支中間產物天冬氨酸半醛生成高絲氨酸，從而使碳流流向合成蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸的分支途徑。天冬氨酸激酶Ⅲ(LysC) 是賴氨酸合成途徑中的特異關鍵酶[29]。而在谷氨酸棒狀桿菌中，只有一種天冬氨酸激酶(LysC)。此外，谷氨酸棒狀桿菌中既可以通過二氨基庚二酸脫氫酶 (Ddh, EC 1.4.1.16) 直接催化四氫二吡啶二羧酸轉化為二氨基庚二酸，也可以通過DapDCEF四步催化完成轉化，而在大腸桿菌中該過程要經歷DapDCEF四步催化才能完成。大腸桿菌中賴氨酸合成的各個步驟都受賴氨酸調控，既包括對天冬氨酸激酶Ⅲ基因 (lysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因 (asd)、二氫吡啶二羧酸還原酶基因(dapB)、四氫二吡啶琥珀酸酶基因 (dapD) 和二氨基庚二酸脫羧酶基因 (lysA) 的轉錄阻遏，又包含對天冬氨酸激酶Ⅲ (LysC) 和二氫甲基吡啶酸合成酶 (DapA) 催化的反饋抑制作用[30]。

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圖3 大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中尸胺的代謝途徑 (左圖為大腸桿菌中，右圖為谷氨酸棒狀桿菌中。粗體箭頭表示基因過表達活性增強，箭頭上帶有X表示該基因被刪除，虛線表示該途徑被弱化)Fig. 3 Metabolic pathway of cadaverine in E. coli and C. glutamicum. The left is in E. coli and the right is in C. glutamicum. Thick arrows indicate increased activity by overexpression, arrows with blue X’s indicate genes that are knocked out, dashed line indicates attenuation.

除了戊二胺合成途徑，戊二胺的代謝還受其降解和轉運的調控[31]。尸胺-賴氨酸反向轉運蛋白CadB既可以依靠離子動力勢攝取戊二胺，又可以分泌戊二胺。大腸桿菌中戊二胺的利用和降解途徑，除了編碼腐胺/尸胺氨基轉移酶的SpeE催化戊二胺為氨丙基戊二胺之外，精胺乙酰轉移酶SpeG催化戊二胺為N-乙酰戊二胺，戊二胺轉氨酶YgjG催化戊二胺為氨基戊醛，腺嘌呤脫氨酶PuuA催化戊二胺的谷氨?；痆32]。在假單胞菌中，戊二胺通過氨基轉換作用代謝為α-哌啶，進一步氧化為δ-氨基戊酸 (AMV)[25]。在谷氨酸棒狀桿菌中，戊二胺也可以和乙酰-CoA作用生成乙酰戊二胺。在一些物種中，戊二胺也是氨基丙酸化和乙?；牡孜颷33]。

圖4 大腸桿菌中Cad系統(tǒng)的調控模型[38]Fig. 4 Regulation Model of the Cad System in E. coli (simplified)[38].

1.2 大腸桿菌中戊二胺誘導合成的調控機制

來自于反芻動物月形單胞菌的ldc基因的ORF長1 182 bp，編碼393個氨基酸，形成的賴氨酸脫羧酶由兩個相同的單體構成[46]。該基因編碼的賴氨酸脫羧酶能夠同時催化賴氨酸和鳥氨酸脫羧，而且對這兩個底物具有相似的Km和Vmax值。但是在該酶的催化結構域里，催化賴氨酸脫羧和催化鳥氨酸脫羧的比率是0.83。該酶和其他已經報道的細菌來源的賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶幾乎沒有氨基酸序列的相似性，但與真核生物的鳥氨酸脫羧酶的氨基酸序列大約有60%的相似性[4]。

2 戊二胺合成途徑的關鍵酶和轉運蛋白

[47] Kashiwagi K, Miyamoto S, Suzuki F, et al. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89: 4529–4533.

賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧形成戊二胺，是戊二胺合成途徑中最關鍵的酶。賴氨酸脫羧酶存在于大腸桿菌Escherichia coli、蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei、耐堿芽胞桿菌Bacillus halodurans、蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus、尸桿菌Bacterium cadaveris、伯克霍爾德氏菌Burkholderia vietnamensia、青紫色素桿菌Chromobacterium violaceum、霍亂弧菌Vibrio cholerae、毛鏈霉菌Streptomyces polosus等[36,39-43]大多數微生物中。賴氨酸脫羧酶也存在于高等植物中，例如黃瓜、家山黧豆等[43]。目前，已經分別從大腸桿菌、蜂房哈夫尼菌、反芻動物月形單胞菌Selenomonas ruminantium、鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium和鮰愛德華氏菌Edwardsiella ictaluri等細菌中克隆出賴氨酸脫羧酶基因[44]。其中對來自于大腸桿菌中的兩種脫羧酶的特性研究較為清楚。

大腸桿菌中有兩種賴氨酸脫羧酶：誘導型酶CadA[34-35]和組成型酶LdcC[36-37]，它們都需要磷酸吡哆醛作為輔助因子。CadA的最適pH是5.5，在pH 8.0時完全失活；LdcC的最適pH是7.6，在廣泛的pH范圍內均有活性[36-37]。在它們各自的最適pH條件下，LdcC的酶活性高于CadA，盡管LdcC和CadA的最適溫度都是52 ℃，但是，CadA在高溫下比較穩(wěn)定，在70 ℃時仍能保持穩(wěn)定，而LdcC從37 ℃開始，隨著溫度升高而逐步失活[37]。厭氧環(huán)境下cadA在賴氨酸存在的情況下通過低pH (5.5) 誘導，表達達到最高水平，尸胺的分泌中和了胞外培養(yǎng)基的pH[34-35]。多數文獻認為，ldcC是組成型表達，且在菌體中其表達水平很低[36]；但也有文獻認為，ldcC不是組成型表達，而是被某種因子抑制，正常條件下轉錄很弱，mRNA不穩(wěn)定[37]。蜂房哈夫尼菌的賴氨酸脫羧酶基因ldc為組成型表達，雖然文獻中沒有直接來自于蜂房哈夫尼菌的賴氨酸脫羧酶的最適溫度和最適pH值，但是，固定化法產該酶的細胞制備1, 5-戊二胺時使用的溫度為37 ℃, pH為5.0[45]。不同來源的賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列一致性比較高，大腸桿菌的ldcC與cadA以及來自于蜂房哈夫尼菌和鼠傷寒沙門氏菌的ldc基因編碼的氨基酸序列相比，相似性分別為69.4%、68.6%和68.9%。大腸桿菌的CadA和蜂房哈夫尼菌的Ldc氨基酸序列相似性為80%，然而只有41%序列具有相同的密碼子。而且它們都表現(xiàn)出特定的底物專一性，只能對賴氨酸進行脫羧反應[44]。

少尿：為了預防脫水和休克，及時補液，預防和治療休克：應及時補充液體和血液，但應避免使用限制腎血管的藥物（如去甲腎上腺素）；治療高鉀血癥：葡萄糖和碳酸氫鈉混合靜脈注射法，鉀離子向細胞轉移，糾正高鉀血癥，也可采用血液透析和腹膜透析。如果有嚴重的高鉀血癥或高分解代謝狀態(tài)，血液透析是最合適的；糾正代謝性酸中毒：代謝性酸中毒在少尿期并不嚴重，只需補充足夠的卡路里，減少身體組織的分解；控制感染：及時控制繼發(fā)感染，選擇無毒的腎臟抗生素如頭孢菌素、紅霉素、氨芐西林等。

兩組患者治療后，Lund-Mackay鼻竇CT掃描評分均下降，與治療前相比具有顯著性差異（P＜0.05）。在治療前，觀察組與對照組的Lund-Mackay鼻竇CT掃描評分之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在治療20天后，觀察組的該項評分低于對照組，且比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

大腸桿菌中有兩種賴氨酸脫羧酶：誘導型酶CadA[34-35]和組成型酶LdcC[36-37]，它們都需要磷酸吡哆醛作為輔助因子。Fritz等建立了大腸桿菌中戊二胺誘導合成的戊二胺操縱子調控機制 (圖4)[38]。戊二胺操縱子包括誘導型啟動子Pcad、賴氨酸脫羧酶基因cadA和賴氨酸-尸胺反向轉運蛋白基因cadB，戊二胺操縱子上游是其調節(jié)基因cadC[34]。戊二胺的合成受pH值和賴氨酸濃度調節(jié)。在低pH值、高賴氨酸濃度條件下，cadC基因被激活，其產物作用于Pcad，啟動cadA、cadB基因表達合成賴氨酸脫羧酶CadA和賴氨酸-尸胺反向轉運蛋白CadB[31]。CadA利用細胞內的質子和賴氨酸合成戊二胺和CO2，同時將合成的戊二胺轉運至細胞外。cadC基因上游有編碼賴氨酸滲透酶的基因lysP，賴氨酸滲透酶基因lysP并不是戊二胺操縱子的組成成分，但它編碼的蛋白LysP能抑制CadC的活性。高濃度的賴氨酸可以抑制LysP蛋白對CadC活性的抑制作用[37]。高濃度戊二胺對cadC基因表達具有抑制作用，還可導致細胞膜孔蛋白的關閉[9]，影響細菌的正常生長。

[3] Francisco J, Flores J, Rincn JF. Characterization of the iron regulated desA promoter of Streptomyces pilosusasa system for controlled gene express ion in actinomycetes. Microb Cell Fact, 2003, 71: 339–349.

2.2 賴氨酸-尸胺反向轉運蛋白

圖5 賴氨酸脫羧酶系統(tǒng)進化樹Fig. 5 Phylogenetic tree of lysine decarboxylase.

賴氨酸-尸胺反向轉運蛋白CadB (Cadaverinelysine antiporter)是一種轉運戊二胺和賴氨酸的跨膜蛋白，與PotE(腐胺-鳥氨酸反向轉運蛋白)[47-50]和AdiC(胍丁胺-精氨酸反向轉運蛋白)[51-52]一樣，都屬于APC超家族轉運蛋白 (Amino acid/polyamine/ organocation superfamily of transporters)[53]，對菌體生長具有重要影響。cadB基因長1 335 bp，與cadA組成cad操縱子，編碼444個氨基酸[34]。大腸桿菌中戊二胺的濃度不只是通過生物合成來維持，也可以通過攝取、分泌、降解進行調節(jié)[31]。由于賴氨酸脫羧酶是胞內酶，合成的戊二胺若在細胞內積累，對細胞具有毒性[54]。Soksawatmaekhin等[31]對CadB的功能進行了詳細研究，表明CadB在細胞中同時具有分泌和吸收功能，既可以經過質子動力攝取戊二胺，也可以進行賴氨酸-戊二胺的逆向轉運，從而分泌戊二胺。尸胺吸收和分泌的Km值分別為20.8、303 μmol/L。在中性pH值下，如果細胞內多胺不足，細胞可以通過CadB少量攝入戊二胺；在酸性pH值下，CadA催化賴氨酸形成戊二胺，CadB將合成的戊二胺轉運到細胞外，維持細胞內外戊二胺的平衡。CadB和CadA對于細胞在酸性pH值下的生長和對酸性的耐受方面具有重要作用。

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Soksawatmaekhin等[54]還進一步鑒定出CadB上與戊二胺吸收和分泌相關的氨基酸殘基：Tyr73、Tyr89、Tyr90、Glu204、Tyr235、Asp303和Tyr423強烈影響戊二胺的吸收和分泌；Trp43、Tyr57、Tyr107、Tyr366和Tyr368主要影響戊二胺的吸收；Arg299主要影響戊二胺的分泌，說明Arg299涉及賴氨酸羧基的識別；Cys370的巰基不僅對戊二胺的氨基識別是必需的，可能還涉及H+的識別。而且，同時涉及戊二胺吸收和分泌、或者僅涉及戊二胺分泌的氨基酸殘基都位于細胞膜的細胞質一側，而僅涉及尸胺吸收的氨基酸殘基位于細胞膜的周質空間一側。Tomitori等[55]還利用已知的AdiC晶體模型模擬了CadB與PotE的結構，三者結構極其相似，只是與底物結合位點的寬度因底物大小而不同。這些研究為CadB的功能改造奠定了基礎。

谷氨酸棒狀桿菌不能合成戊二胺，因此不存在專一的戊二胺轉運蛋白，轉運賴氨酸的轉運蛋白LysE也不能轉運戊二胺。Kind等[56]研究表明，當在谷氨酸棒桿菌中合成戊二胺時，有35種候選基因的表達量上升，其中編碼一種滲透酶的cg2893基因的表達量增加了2.6倍。當該基因被刪除時，戊二胺的分泌降低了90%，而過表達該基因時，戊二胺的產量可提高20%。因此，滲透酶Cg2893可能具有轉運戊二胺的功能。cg2893基因長1 485 bp，編碼494個氨基酸，其核苷酸序列和cadB的相似性為69.42%，其氨基酸序列與CadB的相似性為67%。該基因的發(fā)現(xiàn)為在谷氨酸棒桿菌中研究戊二胺的合成和轉運提供了理論依據。

3 戊二胺生產最佳代謝途徑和產量的預測

計量網絡模型可以通過模擬預測谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌生產戊二胺的潛力，該模型以兩種微生物的基因組序列為基礎進行評估[57]。使用基礎通量模型分析可以推導出生產戊二胺的最大理論產量、最佳途徑、最有前途的目的基因[58]。谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌利用不同的代謝途徑優(yōu)化戊二胺的生產[57]。谷氨酸棒桿菌大量利用戊糖磷酸途徑，而此途徑在大腸桿菌中幾乎未參與戊二胺的合成。合成賴氨酸時，谷氨酸棒桿菌利用特異性的脫氫酶分支途徑，而流向三羧酸循環(huán)的通量為零，相反，大腸桿菌中只使用需要大量通量流向三羧酸循環(huán)的琥珀酰途徑。預測的谷氨酸棒狀桿菌生產戊二胺最高產量是0.43 g/g (0.75 mol/mol)，大腸桿菌則是0.49 g/g (0.84 mol/mol)。這些數值遠遠超過了目前所達到的生產水平，說明我們仍有很大的優(yōu)化空間去生產戊二胺。大腸桿菌中，轉氫酶 (EC 1.6.1.1-2) 催化NAD+和NADPH與NADH和NADP+之間相互轉化的線粒體酶，在網絡模型上刪除轉氫酶時預測產量降低至0.40 g/g。反之，在網絡模型中添加轉氫酶時，預測的谷氨酸棒桿菌最高產量則增加為0.49 g/g。因此，轉氫酶在兩種微生物戊二胺合成途徑中扮演重要的角色。

4 戊二胺代謝工程研究進展

大腸桿菌的遺傳背景清楚，戊二胺的合成機制明確，是研究戊二胺合成的理想宿主之一。研究者或者利用大腸桿菌的靜息細胞合成戊二胺，或者根據大腸桿菌中戊二胺的代謝途徑，對大腸桿菌進行代謝工程改造，利用糖類發(fā)酵直接合成戊二胺。Nishi等利用強啟動子Plac構建過表達cadA的大腸桿菌工程菌，工程菌發(fā)酵后投入底物賴氨酸，戊二胺產量達到69 g/L發(fā)酵液[59]。為了直接利用糖類合成戊二胺，Qian等[32]利用大腸桿菌K12 W3110作為宿主，對戊二胺代謝途徑進行了改造：1) 刪除編碼降解戊二胺的speE、speG、ygjG、puuA和puuP基因，使戊二胺降解和利用途徑失活；2) 利用強啟動子Plac過表達cadA；3) 通過強啟動子Ptrc替換原啟動子過表達lysC、dapA、dapB和lysA來增加底物賴氨酸的合成；4)把ddh整合到染色體的iclR(異檸檬酸裂合酶)調節(jié)基因位點增加草酰乙酸的供給。結果表明：對賴氨酸合成途徑的修飾以及野生型lysC的過表達沒有使戊二胺產量提高，而草酰乙酸的供給是個潛在的瓶頸。最終，大腸桿菌工程菌XQ56合成戊二胺的產量為 0.13 g/g葡萄糖。

谷氨酸棒狀桿菌是生產賴氨酸的高產菌株，賴氨酸是合成戊二胺的前體物質。因此，研究者也選擇谷氨酸棒狀桿菌作為宿主菌株進行代謝工程改造，從而利用糖類發(fā)酵來合成戊二胺。Mimitsuka等[26]首次利用谷氨酸棒桿菌工程菌發(fā)酵葡萄糖來生產戊二胺，將cadA插入谷氨酸棒桿菌的高絲氨酸脫氫酶基因(hom)位點，cadA在卡那霉素抗性基因啟動子調控下表達，發(fā)酵液上清中積累了2.6 g/L戊二胺；研究還表明，由于谷氨酸棒桿菌缺乏戊二胺轉運蛋白，導致戊二胺在細胞內積累，抑制了賴氨酸脫羧酶的活性和戊二胺的合成。Tateno等[60]將淀粉酶基因amyA和cadA同時克隆到谷氨酸棒狀桿菌中共表達，構建成可直接利用可溶性淀粉生產戊二胺的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，尸胺產量達到23.4 mmol/L。本實驗室利用蜂房哈夫尼菌中賴氨酸脫羧酶基因ldc，以大腸桿菌/谷氨酸棒桿菌穿梭質粒pXMJ19為載體，構建工程菌株C. glutamicum TK260512/pXMJl9-ldc。工程菌C. glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc合成的戊二胺產量為0. 96 g/L[61]。

構建戊二胺高產菌株需要對代謝途徑的不同節(jié)點進行改造或修飾，包括中心碳代謝中前體和輔因子優(yōu)化、產物的轉運以及與戊二胺合成代謝流無關的分支代謝途徑的解除或弱化[62]。Kind等[63]對谷氨酸棒狀桿菌中戊二胺代謝途徑進行了改造：1) 在天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶引入點突變 lysC311和pycA458，解除了該酶受到的反饋調節(jié)；2) 過表達回補酶 (Anaplerotic enzyme) 丙酮酸羧化酶基因(pyc)，刪除催化草酰乙酸消耗的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepck)，保證重要前體草酰乙酸的供給；3) 過表達天冬氨酸激酶基因(aspC)、二氫吡啶二羧酸還原酶基因(dapA)、二氨基庚酸脫氫酶基因(ddh)和二氨基庚酸羧化酶基因(lysA)，保證生物合成流流向賴氨酸；4) 高絲氨酸脫氫酶在59位點(hom59)滲漏突變，實現(xiàn)對分支絲氨酸途徑的弱化。5) 利用強啟動子Ptuf調控和密碼子優(yōu)化過表達ldcC，最終戊二胺產量達到200 mmol(0.11 g/g葡萄糖)，該菌株命名為DAP-3c。若加入賴氨酸脫羧酶的輔酶磷酸吡哆醛，戊二胺產量達到300 mmol(0.17 g/g葡萄糖)。此外，該過程中檢測到副產物N-乙酰戊二胺，約占總產物的25%。N-乙酰尸胺是以乙酰-CoA作為乙?；w，經NCgl1469催化戊二胺合成的產物[63]。敲除該基因戊二胺產量增加了11%，葡萄糖向戊二胺的摩爾轉換率達到30%。然而，副產物的代謝流沒有全部流向戊二胺，這可能是受到戊二胺轉運的限制造成的。通過全局轉錄分析 (Global transcription profiling)，從35種候選基因中鑒定出cg2893編碼的滲透酶可能具有轉運戊二胺的功能[64]。敲除該基因戊二胺的分泌降低了90%，而過表達該基因時，戊二胺的產量可提高20%，副產物減少75%。說明增強戊二胺的分泌可以降低戊二胺對賴氨酸脫羧酶的競爭抑制作用，從而提高戊二胺的產量。本實驗將cadB克隆至谷氨酸棒桿菌中，與蜂房哈夫尼菌的ldc基因共表達，在谷氨酸棒桿菌合成戊二胺的同時，幫助戊二胺轉運至細胞外，解除戊二胺的反饋抑制作用。工程菌合成戊二胺的分泌率較C. glutamicum TK260512/pXMJl9-ldc提高了27%[65]，戊二胺的產量也提高了30%。說明CadB可以在谷氨酸棒狀桿菌中表達，且可以將戊二胺轉運至胞外，進而提高戊二胺的產量。

4)利用非對稱孔隙壓力場可以提高煤體定向壓裂效果，控制水壓與水平應力比需要控制在合理的范圍內。研究結果表明：鶴壁礦區(qū)內，煤巖體水平地應力比在1.0～1.8，控制水壓6～12 MPa時定向壓裂效果明顯。

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其二，突出各部門各鄉(xiāng)鎮(zhèn)街道的積極協(xié)同配合。由于“五水共治”不單單是水利和環(huán)保等部門的工作，而是涉及到鄉(xiāng)鎮(zhèn)街道等基層組織的工作，所以就需要通過宣傳報道營造一種各單位、各部門、各鄉(xiāng)鎮(zhèn)街道齊心協(xié)力、共同為“五水共治”獻計出力的氛圍。

Buschke等利用谷氨酸棒狀桿菌共表達木糖異構酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB并在HCE (High constitutive expression) 啟動子調控下過表達cadA，工程菌利用木糖發(fā)酵合成戊二胺，戊二胺產量為13.9 mmol/L發(fā)酵液，轉化率為每mol木糖轉化(164.5±6.9) mmol戊二胺，對應每mol碳轉化(32.9±1.4) mmol戊二胺[67]。碳源轉化為戊二胺的轉化率比較低，可能是碳源轉化成二氧化碳損失過多，以及木糖的轉運機制還不太清楚。為了提高木糖的轉化效率和提高戊二胺產量，Buschke等將木糖合成途徑中的tkt操縱子過表達并刪除戊二胺分解代謝中的lysE和act基因，構建高產戊二胺的谷氨酸棒狀桿菌工程菌C. glutamicum DAP-Xyl1 icdGTGPeftufbp Psodtkt Δact ΔlysE，戊二胺產量達到103 g/L[33]。

5 戊二胺研究前景展望

市場上的完全生物基尼龍產品包括聚酰胺11、聚酰胺1010和聚酰胺46。其中聚酰胺11和聚酰胺1010來源于蓖麻油[68]，聚酰胺46由糖類發(fā)酵得到的產物腐胺和己二酸聚隸屬于荷蘭DSM公司旗下Stanyl品牌[25]。市場上的部分生物基尼龍產品包括聚酰胺610、聚酰胺1012、聚酰胺410和聚酰胺10T，其他的生物基尼龍還處于研發(fā)階段[68]。2012年，日本味之素公司和東麗實業(yè)公司宣布合作開發(fā)生物基尼龍原料1,5-戊二胺。由于谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌的遺傳背景清楚、生長周期短，為戊二胺的合成研究及工業(yè)生產提供了有利依據。然而，無論是大腸桿菌還是谷氨酸棒狀桿菌，雖然中心代謝途徑的改造在一定程度上提高了戊二胺的產量，但戊二胺的合成量遠達不到實際生產要求，還需要大量的基礎研究。賴氨酸脫羧酶是胞內酶，戊二胺滯留在胞內造成對賴氨酸脫羧酶的反饋抑制。已知的戊二胺轉運蛋白只有大腸桿菌中的賴氨酸-尸胺反向轉運蛋白CadB，能夠在谷氨酸棒狀桿菌中表達，但轉化效率還有待提高。而谷氨酸棒狀桿菌中cg2893編碼的滲透酶也可能具有轉運戊二胺的功能，但是谷氨酸棒狀桿菌中不止這一種潛在的戊二胺轉運蛋白，還可能存在未知的轉運蛋白。如果能找到所有的戊二胺轉運蛋白，比較其利弊，篩選出表達量最高的蛋白，這對戊二胺的生產具有重大意義。然而，戊二胺的轉運量增加了，胞外的戊二胺量會明顯增加，這會對細菌的生長造成影響。大腸桿菌在0.2 mol/L戊二胺存在時生長率下降35%，在0.5 mol/L戊二胺存在時仍有菌體生存，但戊二胺濃度在0.3–0.5 mol/L時部分細胞已裂解。大腸桿菌對戊二胺的耐受性低于其對腐胺的耐受性[69]。谷氨酸棒狀桿菌在1 mol/L戊二胺濃度時仍能對數生長，生長率下降約67%[27]。因此，明確戊二胺抑制細菌生長的機制，提高谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌對戊二胺的耐受性是亟需解決的問題。

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推薦理由:黨的十九大報告明確指出：“中國特色社會主義最本質的特征是中國共產黨領導，中國特色社會主義制度的最大優(yōu)勢是中國共產黨領導，黨是最高政治領導力量?！钡环τ腥速|疑中國共產黨的執(zhí)政地位。本書對這些懷疑進行了概括，匯總為十個疑問，以通俗易懂的語言、豐富生動的事例，通過分析中國共產黨的歷史發(fā)展與當代建設，以及在新時代的執(zhí)政理念與施政方略，給予有力的回答。

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水利工程管理工作中可能會遇到很多問題，如果這些問題發(fā)生了，那么我們能做的就是大膽變通，在原來的管理方法基礎上進行創(chuàng)新，創(chuàng)建起和諧的管理模式，不斷適應當前的市場經濟需求。與此同時，為了更好的提升管理水平，提高競爭力，水利單位應形成自己獨有的單位文化，建立屬于自己的管理隊伍，充分發(fā)揮出職工們的工作熱情，從整體上提升管理水平。

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1.搭建學習新平臺，增強學習趣味性。公司打破傳統(tǒng)的集中學習模式，充分利用寶勝文化雜志、網站、辦公OA系統(tǒng)等媒介，建立黨員微信群、黨建工作交流群，實現(xiàn)黨員全覆蓋的溝通、交流和學習。公司OA辦公系統(tǒng)開設“黨建在線”、“黨務公開”、“兩學一做”等專欄，將黨的最新理論、中航最新要求、黨員發(fā)展等內容及時傳達，讓新思想新動態(tài)在指尖滑動中深入腦海。

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從企業(yè)管理的激勵實踐上看，一些企業(yè)在處理物質和精神的關系問題上確實存在二者失衡的現(xiàn)象。有的企業(yè)義利失衡、金錢崇拜、誠信迷失、潛規(guī)則盛行；有的企業(yè)員工精神生活沉淪，沒有工作熱情，對工作、對環(huán)境采用冷漠、忽視的態(tài)度；有的企業(yè)業(yè)余生活單調、人際交流貧乏；有的企業(yè)“拿著令箭當雞毛，在執(zhí)行上級指示的時候打折扣、搞變通”，“內心浮躁，自卑自棄”；有的單位只講規(guī)則、不講感情，干群關系冷漠，團隊凝聚力缺失……如此等等，腐蝕著企業(yè)應有的敬業(yè)、奉獻、拼搏以及創(chuàng)新等良好精神風貌。

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(本文責編 郝麗芳)

Progress in biosythesis of diaminopentane

Dongxia Li, Ming Li, Hongxin Wang, Shuya Wang, and Fuping Lu
Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China

Air pollution and global warming are increasingly deteriorating. Large amounts of polyamides derived from fossil fuel sources are consumed around the world. Cadaverine is an important building monomer block of bio-based polyamides, thus biotechnological processes for these polymers possess enormous ecological and economical potential. Currently, the engineered strains for biological production of cadaverine are Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli. We review here the latest research progress of biosynthesis of cadaverine including metabolism of cadaverine in microorganisms, key enzymes and transport proteins in cadaverine synthesis pathway, optimum pathways and cadaverine yields.

cadaverine, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, lysine decarboxylase (LDC), cadaverine-lysine antiporter (CadB)

May 18, 2013; Accepted: August 20, 2013

Ming Li. Tel: +86-22-60601958; Fax: +86-22-60602298; E-mail: liming09@tust.edu.cn

李東霞, 黎明, 王洪鑫, 等. 生物法合成戊二胺研究進展. 生物工程學報, 2014, 30(2): 161-174.

Li DX, Li M, Wang HX, et al. Progress in biosythesis of diaminopentane. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 161-174.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21176190), Key Technology Research and Development Program of Tianjin, China (No. 11ZCKFSY00900), Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology (No. 11JCYBJC09600), Changjiang Scholars and Innovative Research Team (No. IRT1166).

國家自然科學基金(No. 21176910), 天津市科技支撐計劃 (No. 11ZCKFSY00900), 天津市應用基礎及前沿技術研究計劃(No. 11JCYBJC 09600), 長江學者與創(chuàng)新團隊項目(No. IRT1166) 資助。