龐春淼 呂 艷 孫雯雯 司玉玲 龐 華△

負(fù)載干細(xì)胞抗原的DC聯(lián)合CIK細(xì)胞對(duì)乳腺癌荷瘤鼠腫瘤殺傷研究*

龐春淼1呂 艷1孫雯雯2司玉玲2龐 華2△

目的 研究不同乳腺癌細(xì)胞抗原負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）聯(lián)合培養(yǎng)后對(duì)乳腺癌荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤的殺傷效果。方法分離乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR中的乳腺癌干細(xì)胞并制備凍融抗原，以此沖擊由正常人外周血提取的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC和CIK，注入乳腺癌荷瘤鼠模型中，以此為實(shí)驗(yàn)組（BCSC-AP-DC+CIK組），并與普通抗原沖擊的DC聯(lián)合CIK組（AP-DC+CIK組）、DC+CIK組、CIK組及生理鹽水組（NS組）建立對(duì)照實(shí)驗(yàn)。觀察各組中小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，采用免疫組化法檢測(cè)bcl-2、bax表達(dá)，原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)各組腫瘤組織凋亡。結(jié)果各組小鼠腫瘤體積在治療前后及各組小鼠腫瘤體積在治療后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），NS組小鼠治療后腫瘤體積最大（3.625±0.093）cm3，BCSC-AP-DC+CIK組腫瘤體積最?。?.234±0.131）cm3。BCSC-AP-DC+CIK組bax強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，較其他組強(qiáng)；bcl-2弱陽(yáng)性或不表達(dá)，較其他組弱。凋亡指數(shù)BCSC-AP-DC+ CIK組＞AP-DC+CIK組＞DC+CIK組＞CIK組＞NS組。結(jié)論經(jīng)乳腺癌干細(xì)胞抗原沖擊的DC與CIK作用后誘導(dǎo)同種乳腺癌細(xì)胞凋亡強(qiáng)于經(jīng)普通乳腺癌細(xì)胞抗原沖擊的DC聯(lián)合CIK、單純DC與CIK共同作用后及單獨(dú)CIK的治療效果。

乳腺腫瘤；干細(xì)胞；樹(shù)突細(xì)胞；殺傷細(xì)胞；基因，bcl-2；bcl-2相關(guān)X蛋白；細(xì)胞凋亡

乳腺癌是威脅女性健康的重要疾病，乳腺癌干細(xì)胞（breast cancer stem cell，BCSC）是在乳腺癌治療中引起放化療抵抗、腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的重要原因[1]。尋找一種行之有效的殺滅腫瘤干細(xì)胞的方法成為腫瘤治療的新方向。過(guò)繼免疫療法是近年來(lái)興起的一種新的腫瘤治療方法[2]，特別適用于放化療治療相對(duì)不敏感的腫瘤，已經(jīng)作為臨床上一種重要的治療方法正在逐步推廣。本研究通過(guò)腫瘤干細(xì)胞制備抗原，沖擊樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）后與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）共培養(yǎng)，研究其對(duì)乳腺癌荷瘤鼠腫瘤組織的殺傷情況。

1 材料與方法

1.1 主要材料 （1）SPF級(jí)6～8周齡雌性nod-scid小鼠（許可證號(hào)：scxk京，2006），體質(zhì)量（20.461±1.652）g，購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。（2）RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自天津津浦生物公司，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），白細(xì)胞介素（IL）-4，IL-2，腫瘤壞死因子（TNF）-α，干擾素（IFN）-γ，均購(gòu)自美國(guó)PEPRO TECH公司；流式抗體FITC-CD44、PE-CD24購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司，免疫磁珠抗體CD44、CD24購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司，免疫組化抗體bcl-2、bax購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，原位末端標(biāo)記法（TUNEL）試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞傳代培養(yǎng)及干細(xì)胞鑒定收集 將MCF-7/ADR細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，選取FITC-CD44、PE-CD24流式抗體，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞系中CD44+CD24-乳腺癌干細(xì)胞所占比例。用免疫磁珠分選法選取CD44+CD24-乳腺癌干細(xì)胞，收集備用。

1.2.2 DC和CIK的制備 采集并分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，洗滌后靜置培養(yǎng)4 h，分別收集貼壁細(xì)胞與非貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)為DC：第1天加入IL-4 500 U/mL，GMCSF 600 U/mL，隔日全量換液并補(bǔ)充上述細(xì)胞因子。收集非貼壁細(xì)胞用于誘導(dǎo)CIK，并加入IFN-γ 1 000 U/mL，24 h后加入CD3單抗50 mg/L，添加IL-2 300 U/mL，隔日半量換液1次，并補(bǔ)足IL-2。

1.2.3 乳腺癌荷瘤鼠模型的建立 按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只。無(wú)菌條件下，將乳腺癌干細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，注射0.2 mL于小鼠脂肪墊下。待接種部位出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)、質(zhì)地較硬等指征認(rèn)定為成瘤。

1.2.4 乳腺癌干細(xì)胞抗原及乳腺腫瘤細(xì)胞抗原的制備 分別選取上述經(jīng)磁珠分選提取的MCF-7/ADR腫瘤干細(xì)胞和未經(jīng)干細(xì)胞分選的MCF-7/ADR腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2× 107/mL，反復(fù)凍融離心，吸上清，過(guò)濾除菌。分別制備乳腺癌干細(xì)胞抗原及乳腺腫瘤細(xì)胞抗原。

1.2.5 凍融抗原對(duì)DC的體外致敏沖擊 收集上述誘導(dǎo)培養(yǎng)至第11天的DC，以DC分別與乳腺癌干細(xì)胞抗原和乳腺癌細(xì)胞抗原的比例1∶10加入凍融抗原，繼續(xù)培養(yǎng)16 h，第12天收集備用。

1.2.6 各組治療及對(duì)照處理 待上述荷瘤鼠注射腫瘤細(xì)胞部位長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的腫瘤后，按照分組分別注射治療細(xì)胞。BCSC-AP-DC+CIK組：將經(jīng)腫瘤干細(xì)胞抗原沖擊過(guò)的DC與上述培養(yǎng)的CIK以1∶10的比例混合，調(diào)整細(xì)胞濃度至2× 106/mL，經(jīng)小鼠尾靜脈注射。AP-DC+CIK組：注入經(jīng)乳腺腫瘤細(xì)胞抗原沖擊的DC+CIK。DC+CIK組：注入未經(jīng)抗原沖擊的DC+CIK。CIK組：注入單純成熟CIK。NS組：注入生理鹽水。除NS組外每組的細(xì)胞濃度均為2×106/mL，各組注入量為0.2 mL/次，頻率為1次/周，共治療4周。

1.2.7 荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè) 從治療開(kāi)始，每4 d定時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量荷瘤鼠模型移植瘤大小，記錄a（長(zhǎng)徑）和b（短徑），按公式：體積=a×b×（a+b）/2計(jì)算腫瘤體積。各治療組小鼠于治療后2周后分別處死，剝離腫瘤組織，甲醛固定，制作石蠟切片。

1.2.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)bcl-2、bax表達(dá)情況 組織切片常規(guī)脫蠟及復(fù)水后，用H2O2阻斷內(nèi)源酶。再分別滴入相應(yīng)的bcl-2、bax抗體，4℃冰箱過(guò)夜，滴加二抗后DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.9 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 利用上述制備的石蠟切片，采用TUNEL法參照說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，以DAB試劑做最后顯色。細(xì)胞核呈棕褐色著染或細(xì)胞漿因核DNA逸出呈陽(yáng)性著染者，為凋亡細(xì)胞。每個(gè)腫瘤標(biāo)本于高倍視野下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，每組小鼠凋亡細(xì)胞比例的均數(shù)為本組的凋亡指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，配對(duì)資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析方法，組間多重比較采用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞系中CD44+CD24-細(xì)胞比例 FITC-CD44、PE-CD24抗體標(biāo)記的MCF-7/ ADR細(xì)胞系，CD44+CD24-乳腺癌干細(xì)胞所占比例為23.4%，見(jiàn)圖1。

2.2 荷瘤裸鼠治療前后腫瘤體積比較 治療前5組荷瘤裸鼠間腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)不同治療后，BCSC-AP-DC+CIK組、AP-DC+CIK組、DC+ CIK組和CIK組腫瘤體積減小，NS組腫瘤體積增加（P＜0.05或P＜0.01）。表現(xiàn)為BCSC-AP-DC+CIK組最小，NS組最大，見(jiàn)表1。

2.3 治療后小鼠腫瘤組織HE染色情況 BCSCAP-DC+CIK組小鼠腫瘤組織可見(jiàn)體積較大，胞漿淡染，胞核較大的乳腺癌腫瘤細(xì)胞，其間可見(jiàn)胞體較小，胞質(zhì)少，細(xì)胞核小而圓，呈藍(lán)紫色的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)入腫瘤組織中，見(jiàn)圖2。

Figure 1 The proportion of CD44+CD24-cells in MCF-7/ADR cell lines圖1 MCF-7/ADR細(xì)胞系中CD44+CD24-細(xì)胞所占比例

Table 1 Comparison of tumor volume between all five groups表1 各組小鼠腫瘤體積治療前后比較（n=6，cm3，ˉ±s）

Table 1 Comparison of tumor volume between all five groups表1 各組小鼠腫瘤體積治療前后比較（n=6，cm3，ˉ±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，b與（2）比較，c與（3）比較，d與（4）比較，P＜0.05

組別BCSC-AP-DC+CIK組（1）AP-DC+CIK組（2）DC+CIK組（3）CIK組（4）NS組（5）F治療前2.436±0.007 2.435±0.009 2.434±0.131 2.435±0.058 2.434±0.011 0.058治療后45 d 1.234±0.131 1.598±0.042a1.873±0.045ab2.395±0.260abc3.625±0.093abcd721.648＊＊t 21.909＊＊45.404＊＊28.484＊＊3.639＊30.159＊＊

2.4 小鼠腫瘤bax、bcl-2表達(dá)情況 （1）bax染色情況：BCSC-AP-DC+CIK組bax強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，AP-DC+ CIK組、DC+CIK組、CIK組、NS組的陽(yáng)性強(qiáng)度均弱于前者，且有遞減趨勢(shì)。BCSC-AP-DC+CIK組可見(jiàn)小鼠乳腺癌組織中乳腺細(xì)胞胞漿呈棕黃色彌漫陽(yáng)性，胞核顯色不清，細(xì)胞處于壞死狀態(tài)，周圍侵潤(rùn)的淋巴細(xì)胞呈藍(lán)紫色，胞核小而圓，染色清晰，胞質(zhì)少。DC+CIK組中可見(jiàn)乳腺細(xì)胞胞體大，胞漿棕黃色陽(yáng)性淡染，胞核可見(jiàn)或不可見(jiàn)，腫瘤細(xì)胞周圍可見(jiàn)藍(lán)紫色淋巴細(xì)胞，胞核小，胞質(zhì)少。NS組可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，胞核大，橢圓形或圓形，胞質(zhì)染色陰性或有少數(shù)細(xì)胞弱陽(yáng)性，腫瘤細(xì)胞間未見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖3A～C。（2）bcl-2染色情況：BCSC-AP-DC+ CIK組bcl-2染色弱陽(yáng)性，其他各組染色陽(yáng)性強(qiáng)度呈遞增趨勢(shì)，NS組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。BCSC-AP-DC+CIK組小鼠乳腺癌組織中乳腺細(xì)胞胞漿染色弱陽(yáng)性，部分區(qū)域胞核顯色不清，細(xì)胞處于壞死狀態(tài)。DC+CIK組中可見(jiàn)乳腺細(xì)胞胞體大，部分細(xì)胞胞漿呈棕黃色，胞核大而圓，部分細(xì)胞呈壞死狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞周圍可見(jiàn)藍(lán)紫色淋巴細(xì)胞，胞核小，胞質(zhì)少。NS組小鼠腫瘤細(xì)胞胞漿染色強(qiáng)陽(yáng)性，胞核呈藍(lán)紫色深染，細(xì)胞核大，橢圓形。未見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖3D～F。

2.5 小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況 腫瘤細(xì)胞胞漿淡染，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，非凋亡細(xì)胞細(xì)胞核深紫藍(lán)色，見(jiàn)圖4。BCSC-AP-DC+CIK組、AP-DC+ CIK組、DC+CIK組、CIK組和NS組凋亡指數(shù)依次降低，分別為0.595±0.068、0.556±0.046、0.344±0.051、0.260±0.038、0.123±0.017，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=106.369，P＜0.01；多重比較均P＜0.05）。

3 討論

3.1 現(xiàn)階段乳腺癌治療中的困難及可能的新治療方向 在乳腺癌的治療過(guò)程中，通常能殺滅數(shù)量眾多的乳腺癌細(xì)胞，但研究表明乳腺癌干細(xì)胞對(duì)于放化療均有一定的抵抗性，治療后殘存腫瘤干細(xì)胞的增殖，是導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)的主要原因[3]。近年來(lái)，對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的研究成為尋找乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。腫瘤干細(xì)胞的分選方法有側(cè)群分選法[4]、表面標(biāo)記法[5]、微球體培養(yǎng)法[6]等?，F(xiàn)在普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為CD44+CD24-細(xì)胞是乳腺癌干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD44+CD24-細(xì)胞在MCF-7/ADR細(xì)胞系中所占比例為23.4%。如能選取靶向殺傷此群細(xì)胞的方法，有可能解決乳腺癌治療中的放化療抵抗、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等問(wèn)題。

3.2 過(guò)繼免疫療法在殺傷乳腺腫瘤細(xì)胞中的可行性 在腫瘤治療中，過(guò)繼免疫療法已成為繼放化療后腫瘤患者輔助治療的重要手段之一；廣泛應(yīng)用于治療白血病[7]、腎癌[8]、胃癌[9]等腫瘤，尤其適用于難治復(fù)發(fā)型、腫瘤轉(zhuǎn)移的患者，效果優(yōu)于放療、化療。過(guò)繼免疫療法通過(guò)DC將抗原遞呈給CIK，增強(qiáng)了CIK的殺傷活性。尋找一種特異性較強(qiáng)的抗原對(duì)DC進(jìn)行沖擊，從而達(dá)到靶向殺傷作用是目前的一個(gè)研究方向。王小利等[10]利用攜帶癌胚抗原（CEA）基因的重組人腺相關(guān)病毒（rh-AAV）感染DC誘導(dǎo)獲得抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），可殺傷表達(dá)CEA的乳腺癌細(xì)胞，對(duì)CD44+CD24-腺癌干細(xì)胞也具有一定的殺傷活性，提示免疫治療可能是治療乳腺癌干細(xì)胞潛在有效的手段。本研究則試圖以乳腺癌干細(xì)胞抗原活化DC后與CIK共培養(yǎng)，對(duì)乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行靶向性殺傷。通過(guò)小鼠腫瘤體積測(cè)定、TUNEL檢測(cè)其對(duì)腫瘤的殺傷情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)乳腺癌干細(xì)胞抗原沖擊活化后的DC+CIK確實(shí)具有更強(qiáng)的殺傷乳腺癌細(xì)胞的作用。

3.3 過(guò)繼免疫療法引起腫瘤細(xì)胞凋亡原因 細(xì)胞凋亡過(guò)程涉及一系列蛋白，如Caspase家族蛋白、bcl-2家族蛋白、P53等。bcl-2家族是在細(xì)胞凋亡中有重要作用的一類蛋白質(zhì)[11]。bcl-2家族蛋白位于細(xì)胞線粒體外膜上，該家族包含具有兩種截然不同作用的蛋白，一類是抑制凋亡的基因如bcl-2、bclxl、bcl-w等,另一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因如bax、bak、bok等。其中的bcl-2和bax是最具代表性的兩類蛋白。bcl-2在人的胚胎組織和腫瘤組織中廣泛表達(dá)，是公認(rèn)的抑制凋亡的因子，在實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生中都有重要作用。而bax的作用與bcl-2相反，能夠抑制細(xì)胞凋亡，并且bax是bcl-2的主要抑制因子。bcl-2和bax的共同作用決定了細(xì)胞接受凋亡信號(hào)或抑制凋亡信號(hào)[12]。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中有重要意義，腫瘤的治療主要是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。本課題組既往的研究中采用過(guò)繼免疫療法對(duì)乳腺癌荷瘤鼠的腫瘤組織進(jìn)行殺傷，已經(jīng)證實(shí)DC+CIK對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有殺傷作用[13]。本研究通過(guò)靶向殺傷乳腺癌干細(xì)胞的方法對(duì)乳腺癌荷瘤鼠模型進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)負(fù)載乳腺癌干細(xì)胞抗原的DC+CIK組腫瘤細(xì)胞凋亡率高，bcl-2表達(dá)最弱，bax陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)，印證了負(fù)載乳腺癌干細(xì)胞抗原的BCSC-AP-DC+CIK組相對(duì)于負(fù)載普通乳腺癌抗原的DC+CIK組及其他各組具有更強(qiáng)的殺傷乳腺癌細(xì)胞能力，且其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用是通過(guò)影響bcl-2家族蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。但如何制備出更具有特異性的乳腺癌干細(xì)胞抗原，從而能夠更加具有針對(duì)性地殺傷乳腺癌干細(xì)胞需要深入研究。

Figure 2 The pathological manifestations of breast cancer tissue in BCSC-AP-DC+CIK group（HE,×40）圖2 BCSC-AP-DC+CIK組小鼠乳腺癌組織病理圖片（HE,×40）

Figure 3 Staining of bcl-2-Associated X Protein tumor-bearing specimens（Immunohistochemitry,×40）圖3 荷瘤標(biāo)本bcl-2相關(guān)X蛋白染色（免疫組化,×40）

Figure 4 TUNEL staining in tumor-bearing specimens（×40）圖4 荷瘤標(biāo)本TUNEL染色結(jié)果（×40）

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（2013-10-24收稿 2014-02-08修回）

（本文編輯 李鵬）

Study of Antitumor Effect of Combination of CIK with DC both Pulsed by Breast Cancer Stem Cell Antigen in Mice Model with Tumor

PANG Chunmiao1,LYU Yan1，SUN Wenwen2,SI Yuling2,PANG Hua2
1 Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China；2 Central Laboratory,Tianjin 4th Central Hospital

Objective To investigate the tumor-inhibitory effect of cytokine-induced killer cells（CIK）co-cultured with dendritic cells（DC）pulsed by breast cancer stem cell antigen on the same tumor-bearing mice.MethodsBreast cancer stem cells were isolated from the cell line of MCF-7/ADR and extract lyses antigen of the stem cell was saved. DC and CIK derived from peripheral blood mononuclear cells of healthy individuals were co-cultured and pulsed or unpulsed by the above antigen lyses.This DC+CIK were injected to breast tumorbearing mice(BCSC-AP-DC+CIK group),and were used to compared with the common breast cancer cell antigen(rather than breast cancer stem cell antigen)pulsed DC+ CIK group（AP-DC+CIK group）,DC+CIK group,CIK CIK group and normal saline group（NS group）.The tumor-inhibitory effect were evaluated and compared among all 5 groups through the tumor size,TdT-mediated dUTP nick end labeling test (TUNEL),examining expression level of bcl-2 and bax by immunohistochemistry.ResultsThe tumor size in each group before and after therapy and the tumor size after therapy between each group was of significant difference（P＜0.05）.The maximum size is NS group（3.625±0.093）cm3and BCSC-AP-DC+CIK group is minimum，which is(1.234±0.131)cm3.BCSC-AP-DC+CIK group is of highest expression of bax and apoptotic index value,lowest bcl-2 expression in all 5 groups.ConclusionThe CIK co-cultured with DC pulsed breast cancer stem cell antigen was more effective to induce apoptosis of breast cancer cells than those of CIK cells co-cultured with DC pulsed breast cancer cell antigen，CIK cells co-cultured with DC and CIK cells.

breast neoplasms；stem cells；dendritic cells；killer cells；gene，bcl-2；bcl-2-associated X protein；apoptosis

R737.9

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.012

*天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：09JCYBJC10600）

1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）;2天津市第四中心醫(yī)院腫瘤血液科及中心實(shí)驗(yàn)室

△通訊作者 E-mail：panghua2006@sina.com