劉義賓 馬云富 陳建設(shè) 王銀輝

膠質(zhì)瘤組織中TSSC1的表達及其對膠質(zhì)瘤U87細胞生物學行為的影響

劉義賓 馬云富△陳建設(shè) 王銀輝

目的 研究腫瘤抑制可轉(zhuǎn)移候選基因1(TSSC1)在膠質(zhì)瘤組織中的表達及其對膠質(zhì)瘤U87細胞生物學行為的影響。方法采用Real time-PCR和Western blot檢測80例膠質(zhì)瘤（Ⅰ期25例，Ⅱ期32例，Ⅲ期15例，Ⅳ期8例）組織和瘤旁組織中TSSC1的表達，采用化學合成的針對TSSC1基因的2個小干擾RNA(siRNA-TSSC1-1和siRNATSSC1-2)下調(diào)該基因的表達，通過MTT和Transwell法分別檢測TSSC1對U87細胞增殖、遷移和侵襲的影響。結(jié)果TSSC1在膠質(zhì)瘤組織中的表達低于相應(yīng)的瘤旁組織，同時在臨床分期Ⅲ期、Ⅳ期中較Ⅰ期表達降低，將siRNATSSC1-1和siRNA-TSSC1-2轉(zhuǎn)染入U87細胞后，U87細胞中TSSC1 mRNA和蛋白表達水平都明顯降低，細胞增殖能力顯著增強，細胞的遷移和侵襲能力顯著增強。結(jié)論TSSC1有望成為膠質(zhì)瘤早期診斷和預測預后的生物分子標志物。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；RNA,小分子干擾;腫瘤抑制可轉(zhuǎn)移候選基因1;U87細胞

膠質(zhì)瘤發(fā)病率約占腦腫瘤的50%左右，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有侵襲性生長、無控性增殖、易復發(fā)的特點[1-2]。其本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，由于原癌基因的過表達，同時伴隨抑癌基因的突變?nèi)笔В瑥亩鼓[瘤細胞逃避了正常生長的調(diào)控機制。傳統(tǒng)治療方法（包括手術(shù)、化療和放療）并沒有完全解決膠質(zhì)瘤侵襲性生長所導致的高復發(fā)率和低治愈率難題。針對與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因異常的治療已成為研究熱點[3]。腫瘤抑制可轉(zhuǎn)移候選基因1（TSSC1）是一個新發(fā)現(xiàn)的腫瘤基因，可能在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。 Shore等[5]研究表明，TSSC1可抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，TSSC1能轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)RUNX2啟動子的活性，從而抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。但有關(guān)TSSC1在膠質(zhì)瘤惡性腫瘤中的表達及其與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲的關(guān)系尚鮮見報道。本研究通過檢測膠質(zhì)瘤原發(fā)組織和瘤旁組織中TSSC1的表達，觀察TSSC1的表達對膠質(zhì)瘤細胞系U87生物學行為的影響，為深入研究膠質(zhì)瘤的分子病理機制及臨床治療提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 U87惡性膠質(zhì)瘤細胞系購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。80例膠質(zhì)瘤組織標本及對應(yīng)瘤旁組織取自2001年6月—2009年10月我院收治的膠質(zhì)瘤患者，按照WHO標準(2008年修改版)將膠質(zhì)瘤標本分級，所有標本經(jīng)病理證實，其中Ⅰ期25例，Ⅱ期32例，Ⅲ期15例，Ⅳ期8例。組織樣本經(jīng)液氮速凍后-80℃保存。所有樣本采集和使用均征得患者同意并簽署知情同意書后由我院倫理委員會同意。

1.2 Real time-PCR檢測TSSC1 mRNA的表達 采用TRIZOL一步法快速提取細胞及組織總RNA。取2 μg總RNA于37℃在逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑作用下進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA的合成體系參照文獻[7]。引物及探針均由上海生工生物工程公司合成。20 μL反應(yīng)體系中包括由40 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，10 μL Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG，10 μmol/L的上下游引物和TaqMan探針各0.4 μL。PCR反應(yīng)條件為50℃溫育2 min，95℃預變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火延伸1 min，40個循環(huán)。CT值為熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)。每個樣本中每個基因的檢測均重復3次?！鰿T值為各樣本中目的基因的CT值與管家基因GAPDH的CT值之差，2-△CT則為該樣本中TSSC1相對于GAPDH的mRNA表達量。

1.3 Western blot檢測細胞及組織中TSSC1蛋白的表達 制備4%濃縮膠和10%分離膠的聚丙烯酰胺垂直平板凝膠，40 μg總蛋白經(jīng)80 V電壓電泳3 h后，電轉(zhuǎn)70 V 3 h轉(zhuǎn)印至PVDF膜。含5%ECL化學發(fā)光試劑盒的TBS-T（pH 8.3）室溫封閉1 h后加入鼠抗人TSSC1一抗，以β-actin為內(nèi)參。4℃平搖過夜，TBS-T洗膜6次后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜6次，加ECL Western blot檢測試劑顯色1～2 min，曝光X線膠片。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染 針對TSSC1基因的2個小干擾RNA(siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2)購自上海吉瑪公司，陰性對照(siRNA）由上海吉瑪公司贈送。實驗分為（1）空白對照組：無處理的U87細胞。（2）陰性對照組：轉(zhuǎn)染siRNA。（3）實驗組1：轉(zhuǎn)染siRNA-TSSC1-1。（4）實驗組2：轉(zhuǎn)染siRNA-TSSC1-2。U87細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司），培養(yǎng)基加入100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素，于37℃、5%CO2培養(yǎng)至對數(shù)生長期或80%飽和度。接種2×105個細胞/孔于6孔板，以無抗生素的含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。100 nmol/L siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2分別和2 μL Lipofectamine 2000各溶于50 μL培養(yǎng)基，孵育5 min后混合20 min，緩慢滴入置于500 μL OPTI-DMEM無血清培養(yǎng)基的細胞中，6 h后將培養(yǎng)液更換為含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后用于基因表達檢測、蛋白表達和細胞生物學行為實驗。

1.5 MTT檢測轉(zhuǎn)染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2后細胞增殖能力 U87細胞分別轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體、siControl、siRNATSSC1-1、siRNA-TSSC1-2，48 h后，胰酶消化對數(shù)期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整至1 000～10 000個細胞/孔。5%CO2、37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，設(shè)3個復孔,于24、48、72 h后每孔加入10 mL MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心用PBS沖2～3遍后。每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm處測量各孔的吸光度（A）值。

1.6 Transwell檢測轉(zhuǎn)染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2后細胞的遷移和侵襲能力 將懸浮于500 μL無血清培養(yǎng)基的5×104個siControl、siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2細胞分別接種于含Metrigel和不含Metrigel的transwell上室，下層加入750 μL含10%FBS的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)8 h。取出transwell小室，用棉簽拭去上層未穿過的細胞，蘇木素染色后封片，于鏡下觀察穿孔細胞數(shù)目。

1.7 統(tǒng)計學方法 用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TSSC1在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織表達水平比較 TSSC1在膠質(zhì)瘤組織較瘤旁正常腦組織中表達下調(diào)，見圖1、2。

Figure 1 TSSC1 mRNA transcription level in glioma tissue(T) and paraneoplastic normal brain tissue(N)圖1 膠質(zhì)瘤組織及瘤旁正常組織中TSSC1 mRNA表達水平

Figure 2 TSSC1 protein expression levels in glioma tissue(T)and paraneoplastic normal brain tissue(N)圖2 膠質(zhì)瘤組織及瘤旁正常組織TSSC1蛋白表達水平

2.2 TSSC1表達與臨床分期的關(guān)系 TSSC1在Ⅰ期中表達水平較高，Ⅲ期、Ⅳ期中表達水平明顯降低，見圖3、4。

Figure 3 Real time-PCR analysis of TSSC1 mRNA transcription levels in glioma of different grade圖3 不同臨床分期膠質(zhì)瘤組織中TSSC1 mRNA表達比較

Figure 4 Western blot anlaysis of TSSC1 protein expression levels in glioma of different grade圖4 不同臨床分期膠質(zhì)瘤組織中TSSC1蛋白表達水平

2.3 轉(zhuǎn)染效率的鑒定 實驗組1和實驗組2中TSSC1 mRNA和蛋白表達水平較空白對照組和陰性對照組降低，見圖5、6。

Figure 5 Real time-PCR analysis of TSSC1 mRNA transcription level in TSSC1 siRNAs-transfected and control U87 cells圖5 轉(zhuǎn)染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2后TSSC1 mRNA表達水平

Figure 6 Western blot analysis of the TSSC1 protein expression in TSSC1 siRNAs-transfected and control U87 cells圖6 轉(zhuǎn)染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2后TSSC1蛋白表達水平

2.4 沉默TSSC1對細胞增殖的影響 培養(yǎng)1～5 d時，各組細胞增殖率差異無統(tǒng)計學意義，培養(yǎng)7、9 d時，實驗組細胞增殖能力較對照組顯著增強（P＜0.01），見表1。

Table 1 Depletion of TSSC1 promotes U87 cell proliferation shown by MTT assay表1 MTT檢測各組吸光度 （n=5，A570±s）

Table 1 Depletion of TSSC1 promotes U87 cell proliferation shown by MTT assay表1 MTT檢測各組吸光度 （n=5，A570±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，P＜0.01

組別空白對照組陰性對照組實驗組1實驗組2 F 1 d 0.26±0.07 0.25±0.05 0.25±0.08 0.24±0.05 2.500 3 d 0.45±0.09 0.47±0.10 0.52±0.11 0.48±0.15 3.146 5 d 1.19±0.12 1.21±0.14 1.38±0.21 1.46±0.27 3.145 7 d 2.00±0.29 2.11±0.30 2.70±0.34a2.66±0.41a18.105＊＊9 d 2.58±0.32 2.55±0.26 3.30±0.41a3.25±0.39a21.778＊＊

2.5 沉默TSSC1對細胞遷移和侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2組細胞的遷移能力高于對照組（F=22.447，P＜0.01），見圖7。轉(zhuǎn)染siRNA-TSSC1-1和siRNA-TSSC1-2組細胞的侵襲能力也高于對照組（F=25.671，P＜0.01），見圖8。

Figure 7 Transwell analysis of the cell migration ability圖7 Transwell檢測各組遷移能力的改變

Figure 8 Transwell analysis of the cell invasion ability圖8 Transwell檢測各組侵襲能力的改變

3 討論

膠質(zhì)瘤患者預后極差，傳統(tǒng)的治療方法，包括手術(shù)、放療和化療不能顯著改善患者生存。近年來，隨著腫瘤分子生物學技術(shù)的發(fā)展和對腫瘤發(fā)病機制的認識不斷加深，針對某些關(guān)鍵基因的分子靶向治療或?qū)肽承┮职┗虺蔀槟[瘤治療的熱點。

TSSC1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤抑制基因，其基因定位于11q15.5上，編碼1.7 ku的蛋白，是癌相關(guān)成纖維蛋白，在正常組織中高表達,是腫瘤抑制基因[8]。本研究發(fā)現(xiàn)TSSC1在膠質(zhì)瘤原發(fā)組織中的表達量低于瘤旁正常腦組織，且在臨床分期Ⅲ期、Ⅳ期中較Ⅰ期表達降低，這與Cai等[9]研究報道TSSC1在乳腺癌組織和發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的組織中低表達，抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移結(jié)果一致，提示其是一個潛在的分子標志物，可作為臨床分期的輔助指標。但TSSC1與患者預后及放化療敏感性的關(guān)系還有待進一步研究。

最新研究表明，在乳腺癌嗜骨轉(zhuǎn)移性細胞系MDA-MB-231中TSSC1 mRNA和蛋白均較正常乳腺細胞低表達，并能抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為，提示其是一個潛在的抑癌基因[6]。同時，Runx2能結(jié)合于TSSC1啟動子區(qū)并轉(zhuǎn)錄，抑制TSSC1啟動子活性，從而促進乳腺癌細胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[6]，TSSC1抑制乳腺癌細胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默膠質(zhì)瘤細胞U87中TSSC1的表達，發(fā)現(xiàn)其能顯著促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖、運動和侵襲等生物學行為。因此筆者推測TSSC1可能參與腫瘤血管生成，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

綜上，TSSC1在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，其在膠質(zhì)瘤中具有較高的診斷價值，可能作為腦膠質(zhì)瘤基因治療的候選基因，但能否作為膠質(zhì)瘤治療的靶基因，及其內(nèi)在分子生物學機制有待進一步研究。

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（2013-10-18收稿 2014-01-21修回）

（本文編輯 閆娟）

Expression of TSSC1 in Glioma Tissue and Its Effect on Cell Biological Behavier of Glioma U87 Cells

LIU Yibin,MA Yunfu,CHEN Jianshe,WANG Yinhui
Department of Neurosurgery,the fourth Affiliated Hospital of Zhengzhou University

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of TSSC1 in glioma patients and its influence on cell biological behavior of glioma U87 cells.MethodsRT-PCR and Western blot were used to examine the expression of TSSC1 in glioma samples,including 80 normal paraneoplastic tissues and 80 primary tumors.MTT and transwell were used to analyze the effect of TSSC1 knockout on proliferation,migration,and invasion in U87 cells.ResultsTSSC1 is down-regulated in glioma compared to its paraneoplastic counterparts and negatively related to higher grade.Furthermore,knockdown of TSSC1 expression results in increased proliferation,migration and invasion in U87 cells in vitro.ConclusionOur results may worked as a marker for early diagnosis and prognosis of glioma.

glioma；RNA,small interfering；TSSC1；U87 cell

R739.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.008

鄭州大學第四附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（郵編450000）

△通訊作者 E-mail：mayunfu126@126.com