劉 輝 李建宇 王鳳梅 王 鵬 李成龍 駱 瑩 朱爭艷△

HBV感染的肝癌患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平分析*

劉 輝1李建宇2王鳳梅1王 鵬1李成龍1駱 瑩1朱爭艷1△

目的 檢測乙肝病毒(HBV)感染的肝癌患者外周血中CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的水平，分析其與HBV感染的相關(guān)性。方法采集41例感染HBV的肝癌患者（HBV+組）、34例未感染HBV的肝癌患者（HBV-組）及29例正常健康受試者（對(duì)照組）的外周抗凝血，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組受試者外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs水平，通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測感染HBV的肝癌患者血清中HBV DNA載量，分析Tregs水平與HBV DNA載量的相關(guān)性。結(jié)果HBV+組外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs占CD4+T細(xì)胞的比率顯著高于HBV-組和對(duì)照組[(8.24±2.20)%vs(7.06±2.46)%vs(6.51±1.99)%,P＜0.05]，HBV-組高于對(duì)照組；CD4+CD25+CD127lowTregs水平與HBV DNA載量(取對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換)呈正相關(guān)(r=0.350，P＜0.05)。結(jié)論肝癌患者外周血中Tregs的水平異常增高，且與HBV DNA復(fù)制密切相關(guān)，這可能是肝癌細(xì)胞免疫逃逸的重要原因。

肝腫瘤；肝炎，乙型；T淋巴細(xì)胞,調(diào)節(jié)性；免疫功能；CD127

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，乙肝病毒(HBV)感染是肝癌發(fā)病的主要原因，許多肝癌患者體內(nèi)都可檢測到HBV DNA的復(fù)制[1]。研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA具有4個(gè)開放的閱讀框，其中X基因編碼蛋白可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的癌變及惡性進(jìn)展[2]。目前，針對(duì)肝癌的傳統(tǒng)治療效果均不甚理想，免疫治療正逐漸成為肝癌臨床治療的一種輔助或替代療法。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)是具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群，在免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)及自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤患者體內(nèi)Tregs水平異常升高，提示Tregs對(duì)免疫應(yīng)答的抑制作用可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，Tregs水平的變化可以準(zhǔn)確反映肝癌的惡性程度與進(jìn)展水平[5]，但關(guān)于Tregs水平與HBV DNA復(fù)制的相關(guān)性還未完全闡明。本研究通過檢測HBV感染的肝癌患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs的水平，分析其水平差異與HBV DNA載量變化的相關(guān)性，探討肝癌發(fā)生發(fā)展中的免疫逃逸機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6月—2013年6月入住我院肝內(nèi)科的75例原發(fā)性肝癌患者，診斷參照第四屆全國肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議制定的《原發(fā)性肝癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)》，其中41例感染HBV(HBV+組)，34例未感染HBV(HBV-組)，所有患者均排除藥物、乙醇及其他肝炎病毒感染等原因造成的肝臟損害，且在半年內(nèi)未經(jīng)免疫抑制劑及抗病毒治療。另選取正常健康受試者29例為對(duì)照組，經(jīng)查體，血尿常規(guī)、心電圖、胸片、腹部B超及肝腎功能、肝病自身抗體均無異常。

1.2 試劑及儀器 鼠抗人單克隆抗體：anti-CD4-FITC抗體、anti-CD25-PECY5抗體、anti-CD127-PE抗體及各自的同型對(duì)照(美國Beckman公司)；HBV DNA定量檢測試劑盒(北京達(dá)安基因有限公司)；Epics Altra流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)，KDC-1042離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，ViiATM7熒光定量PCR儀(美國Life公司)，CHA-S恒溫振蕩器(江蘇金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.3 CD4+CD25+CD127lowTregs水平的檢測 采集受試者外周靜脈血，加入EDTA進(jìn)行抗凝處理，利用CD4、CD25、CD127三抗原標(biāo)記法檢測Tregs水平。具體操作如下：每個(gè)樣品分設(shè)檢測管和對(duì)照管。檢測管內(nèi)依次加入CD4-FITC抗體、CD25-PECY5抗體及CD127-PE抗體各10 μL，對(duì)照管內(nèi)依次加入CD4-FITC抗體、CD25同型對(duì)照-PECY5抗體及CD127同型對(duì)照-PE抗體各10 μL，而后分別向檢測管和對(duì)照管內(nèi)加入受試者的抗凝外周血100 μL，混勻，避光孵育30 min，加入4.5 mL溶血素溶血，37℃避光振蕩10 min，1 600 r/min離心5 min，棄上清，加入1%多聚甲醛固定后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。利用Expo32軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析CD4+CD25+CD127lowTregs細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率。

1.4 HBV DNA載量的測定 采用熒光定量PCR法檢測感染HBV的肝癌患者血清中HBV DNA載量，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出目的基因DNA的分子拷貝數(shù)，并將DNA拷貝數(shù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs的檢測水平比較 HBV+組的CD4+CD25+CD127lowTregs水平高于HBV-組和對(duì)照組，HBV-組高于對(duì)照組(P＜0.05)，見圖1、表1。

Figure 1 CD4+CD25+CD127lowTregs level in different groups圖1 各組受試者CD4+CD25+CD127lowTregs水平比較

Table 1 The CD4+CD25+CD127lowTregs level in different groups表1 各組外周血CD4+CD25+CD127lowTregs水平比較（±s）

Table 1 The CD4+CD25+CD127lowTregs level in different groups表1 各組外周血CD4+CD25+CD127lowTregs水平比較（±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與HBV-組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組HBV-組HBV+組F n 29 34 41 CD4+CD25+CD127low/CD4+(%) 6.51±1.99 7.06±2.46a8.24±2.20ab7.397＊

2.2 HBV+肝癌患者CD4+CD25+CD127lowTregs水平與HBV DNA載量的相關(guān)性 HBV+肝癌患者的CD4+CD25+CD127lowTregs水平與HBV DNA載量(經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換為4.59±1.36)呈正相關(guān)(r=0.350，P＜0.05)。

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其惡性度高，易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[6]，我國肝癌發(fā)病人數(shù)占全球肝癌患者的55%[7]。目前，針對(duì)肝癌的傳統(tǒng)治療效果均不甚理想，其中手術(shù)切除率較低，而全身化療和放療方法，因腫瘤反應(yīng)率低、不良反應(yīng)大，已淡出肝癌的主流治療[8]。因此，探索有效的免疫治療途徑，對(duì)降低肝癌患者的病死率將具有重要意義。

Tregs是一類在腫瘤免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞亞群。研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤患者體內(nèi)Tregs水平異常增高，降低Tregs水平或阻斷其活性可提高腫瘤免疫治療的有效性[4]。目前關(guān)于Tregs在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用還不明確，研究結(jié)果不一致[9]，這主要是由于流式檢測中抗體的標(biāo)記手段不同所致[10]。傳統(tǒng)的方法主要是通過CD25標(biāo)記Tregs水平，但CD25陽性的Tregs在很大程度上與CD4陽性的T細(xì)胞相重疊，影響了Tregs的準(zhǔn)確檢出。因此，尋找Tregs的特異性標(biāo)記物是近年來的研究熱點(diǎn)。CD127(白細(xì)胞介素-7受體，IL-7R)是最新發(fā)現(xiàn)的一種與Tregs密切相關(guān)的表面抗原，可作為識(shí)別Tregs的理想標(biāo)記物[11]。研究發(fā)現(xiàn)，利用CD4+CD25+CD127low標(biāo)記的T細(xì)胞具備了Tregs的典型特征，通過該方法可深入探討Tregs的免疫功能及各類腫瘤的發(fā)病機(jī)制[12]。本研究前期通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)肝癌患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTregs水平進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)Tregs水平的變化可以準(zhǔn)確反映肝癌的惡性程度與進(jìn)展水平[5]，但關(guān)于不同肝癌患者體內(nèi)Tregs水平變化的調(diào)控機(jī)制還不清楚。

HBV感染被認(rèn)為是肝癌發(fā)病的主要原因，不同肝癌患者體內(nèi)Tregs水平的差異可能與HBV感染及其DNA復(fù)制有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同肝癌患者體內(nèi)的Tregs水平均顯著高于健康受試者體內(nèi)的Tregs水平，與前期研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了Tregs在肝癌發(fā)生發(fā)展中的促進(jìn)作用。另外，感染HBV的肝癌患者體內(nèi)Tregs水平顯著高于未感染HBV的肝癌患者體內(nèi)Tregs水平，提示HBV可能參與了肝癌患者體內(nèi)Tregs水平的調(diào)控。本研究還發(fā)現(xiàn)肝癌患者體內(nèi)的Tregs水平隨HBV DNA載量的增高而逐漸升高，兩者呈正相關(guān)，提示肝癌患者體內(nèi)HBV的復(fù)制可能促進(jìn)了Tregs水平的上調(diào)。

綜上，肝癌患者體內(nèi)CD4+CD25+CD127lowTregs的水平異常增高，且HBV DNA的復(fù)制可能促進(jìn)了Tregs的免疫抑制效應(yīng)，這可能是肝癌細(xì)胞免疫逃逸的重要原因。

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（2013-12-17收稿 2012-02-01修回）

（本文編輯 閆娟）

Analysis of CD4+CD25+CD127lowRegulatory T Cells in Peripheral Blood of Hepatocellular Carcinoma Patients with HBV Infection

LIU Hui1,LI Jianyu2,WANG Fengmei1,WANG Peng1,LI Chenglong1,LUO Ying1,ZHU Zhengyan1
1 Institute of Hepatobiliary Disease,Tianjin Third Central Hospital,Tianjin Key Laboratory of Artificial Cell,Tianjin 300170, China；2 Department of Chemical Pharmacy,Logistics College of Chinese People’s Armed Police Forces

ObjectiveTo investigate the level of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells(Tregs)in the peripheral blood of hepatocellular carcinoma(HCC)patients with HBV infection and to explore the relationship between these cells and HBV infection.MethodsPeripheral blood mononuclear cells were isolated from 41 HCC patients infected with HBV,34 HCC patients without HBV infection and 29 healthy persons.These mononuclear cells were labeled with the monoclonal antibodies of CD4,CD25 and CD127,and then Tregs level was determined by flow cytometry(FCM).Moreover,the load of HBV DNA in the blood serum of HCC patients with HBV infection was detected by fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).ResultsThe percentage of CD4+CD25+CD127lowTregs in CD4+T cells in the HCC patients with HBV infection was higher than that in the HCC patients without HBV infection[(8.24±2.20)%vs(7.06±2.46)%,P＜0.05]and that in the healthy persons[(8.24±2.20)%vs(6.51±1.99)%,P＜0.01].Furthermore,the percentage of CD4+CD25+CD127lowTregs in CD4+T cells in the HCC patients without HBV infection was higher than that in the healthy persons[(7.06±2.46)%vs(6.51± 1.99)%,P＜0.05].In addition,the level of CD4+CD25+CD127lowTregs in the HCC patients with HBV infection was gradually increased following the increase of HBV DNA load and there was a positive correlation between the level of CD4+CD25+CD127lowTregs and the load of HBV DNA(r=0.350，P＜0.05).ConclusionThe level of CD4+CD25+CD127lowTregs in HCC patients is increased remarkably and associated with the number of HBV DNA copy,which may be an important mechanism of immunologic escape of virus in HCC.

liver neoplasms;hepatitis B;T-lymphocytes,regulatory;immunologic function;CD127

R392.1，R735.7

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.005

*天津市科委面上項(xiàng)目(編號(hào)：13JCYBJC22500)；天津市衛(wèi)生局科技基金(項(xiàng)目編號(hào)：2010KY03)；天津市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化專項(xiàng)資金(項(xiàng)目編號(hào)：津發(fā)改高技[2006]26號(hào))

1天津市第三中心醫(yī)院肝膽疾病研究所，天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300170）；2武警后勤學(xué)院藥物化學(xué)教研室

△通訊作者 E-mail：Zhuzhengyan59@163.com