艾 辰 譚小月 張勉之 張大寧

五味子醇提液對阿霉素損傷足細胞中nephrin和desmin表達的影響*

艾 辰1譚小月2張勉之3△張大寧4

目的 觀察五味子醇提液（SE）對阿霉素（ADR）誘導(dǎo)的體外足細胞損傷中足細胞裂孔膜蛋白nephrin和骨架蛋白desmin表達的影響，并探討其作用機制。方法體外ADR作用于足細胞24 h，造成足細胞損傷后，加入含SE的培養(yǎng)基，繼培養(yǎng)24 h。設(shè)對照組（0 mg/L ADR）、模型組（0.25 mg/L ADR）、SE干預(yù)組（250 mg/L SE+0.25 mg/L ADR）、SE組（250 mg/L SE）。免疫熒光法測定各組nephrin的表達；Western Blot檢測各組nephrin和desmin蛋白表達；RT-PCR檢測各組nephrin和desmin mRNA表達。結(jié)果免疫熒光結(jié)果顯示對照組和SE組nephrin呈顆粒狀或線性分布于細胞膜，模型組較對照組、SE組和SE干預(yù)組表達強度明顯減少。模型組nephrin蛋白和mRNA表達較對照組顯著減少，SE干預(yù)組nephrin蛋白和mRNA表達水平較模型組增加。模型組desmin蛋白和mRNA表達較對照組顯著增加，SE干預(yù)組desmin蛋白和mRNA表達水平較模型組顯著減少（均P＜0.05）。SE和SE干預(yù)組的nephrin和desmin蛋白和mRNA表達水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論250 mg/L SE對體外培養(yǎng)足細胞無損傷作用，且SE能拮抗ADR對足細胞的損傷，這可能與SE可以上調(diào)nephrin和下調(diào)desmin的表達有關(guān)。

五味子科；足細胞；膜蛋白質(zhì)類；阿霉素；nephrin；desmin

腎小球足細胞是一種高度分化的細胞，在體內(nèi)足細胞伸出足突包繞在基底膜上，形成的裂孔隔膜在腎小球濾過屏障中起重要作用；細胞骨架對維持足細胞的正常形態(tài)有重要的作用。因此足細胞損傷是腎臟疾病進行性病變的基本特征[1]。五味子作為傳統(tǒng)中藥，有斂肺滋腎的作用，大劑量的五味子可使腎臟病變程度明顯改善，減少尿蛋白、改善腎臟功能及免疫學(xué)指標。本研究借助小鼠足細胞系，通過采用體外阿霉素（ADR）導(dǎo)致足細胞損傷，觀察五味子醇提液（SE）對足細胞中裂孔膜蛋白nephrin和骨架蛋白desmin表達的影響，探討SE對足細胞損傷的干預(yù)保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 ADR為美國Sigma公司出品，用滅菌生理鹽水配制成5 g/L的儲存液，儲存于-20℃冰箱，實驗前應(yīng)用時，用新鮮培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。五味子由天津市藥物研究院制備。

1.1.2 試劑 RPMI-1640（美國Corning）培養(yǎng)液中，含10%特級胎牛血清（美國Gibco），青、鏈霉素各100 U/mL（美國Gibco），重組小鼠γ干擾素（IFN-γ）10 U/mL購自R＆D公司。Trizol試劑盒及電泳瓊脂糖均購自日本Takara公司。所用抗體均由美國Santa Cruz公司生產(chǎn)。引物由生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 SE的制備 將五味子300 g用95%乙醇加熱回流3 h，提取2次，合并提取液，靜置過濾，減壓回收乙醇濃縮成浸膏，-20℃保存[2]。

1.2.2 足細胞培養(yǎng) 小鼠足細胞系MPC5由南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊卓教授惠贈。培養(yǎng)方法參照文獻[3]：足細胞于33℃在重組小鼠IFN-γ誘導(dǎo)下增殖；繼而接種到涂有10 mg/LⅠ型膠原的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃不含IFN-γ的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～14 d，足細胞停止增殖，獲得分化表型，達80%左右融合時進行下一步實驗。

1.2.3 實驗分組及刺激 ADR以0.25 mg/L加入培養(yǎng)的足細胞，作用24 h，造成足細胞明顯損傷后，再加入含有250 mg/L SE的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分為對照組（0 mg/L ADR）、模型組（0.25 mg/L ADR）、SE干預(yù)組（250 mg/L SE+0.25 mg/L ADR）、SE組（250 mg/L SE）。

1.2.4 免疫熒光染色 用間接免疫熒光法檢測各組細胞nephrin的表達。棄去各組細胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，4%多聚甲醛室溫固定20 min；繼而0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X100）處理5 min。PBS液清洗后用3%胎牛血清蛋白（BSA）室溫封閉1 h，一抗孵育4℃過夜。PBS清洗5 min×3次，然后加入熒光素標記的二抗，避光室溫孵育1 h。PBS清洗5 min，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核，PBS洗5 min×3次。最后用水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察nephrin表達。

1.2.5 Western Blot檢測檢測nephrin和desmin蛋白表達 接種于6孔板中的各組細胞以預(yù)冷PBS液洗2次，加入50 μL預(yù)冷蛋白裂解液，冰上裂解30 min，細胞刮刀收集樣本。2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉（BCA）法蛋白定量、配樣，100℃、10 min變性后上樣。經(jīng)10%聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。用等滲鹽溶液加Tris-HCL緩沖液（TBST）沖洗后加nephrin、desmin及β-actin的一抗，4℃孵育過夜。TBST液沖洗，加標記辣根過氧化物酶的二抗孵育。洗膜后ECL顯色，X線片曝光，沖洗，掃描。以β-actin為內(nèi)參，檢測nephrin和desmin蛋白的表達。

1.2.6 RT-PCR檢測nephrin和desmin mRNA的表達 采用Trizol試劑盒從接種到6孔板中的各組細胞提取總RNA。紫外分光光度儀檢測mRNA的含量和純度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后在瓊脂凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像后以GAPDH為內(nèi)參，用Image J數(shù)碼圖像分析軟件進行分析，以擴增片段與GAPDH`的灰度比值進行半定量分析。nephrin引物上游5′-TCCTGCTGCGATGGTGGTTG-3′,下游5′-GTCTGGGTTGCCTCCGATGG-3′，擴增片段311 bp；desmin引物上游5′-GCTTCGCCAACTACTTCGAG-3′，下游5′-GTGAGGTCTGGCTTGGACAT-3′，擴增片段441 bp；GAPDH引物上游5′-AAGAACAGGCTCTTAGCA-3′，下游5′-CCAGTAGACTCCACGACAT-3′，擴增產(chǎn)物片段134 bp。逆轉(zhuǎn)錄采用兩步反轉(zhuǎn)法：70℃10 min，冰上2 min；加入Rnase及MMLV后42℃1 h，70℃10 min，置于冰上。反應(yīng)條件：94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸5 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光結(jié)果 對照組與SE組足細胞nephrin以顆粒狀或線性分布于細胞膜，并有聚集中心團塊在核周分布，呈連續(xù)性表達；模型組表達量明顯減弱，部分區(qū)域未見表達或缺失；SE干預(yù)組較模型組表達量增強，見圖1。

2.2 Western Blot結(jié)果 模型組nephrin表達低于對照組、SE干預(yù)組和SE組，模型組desmin表達高于對照組、SE干預(yù)組和SE組（均P＜0.05）；對照組和SE組、對照組和SE干預(yù)組中nephrin和desmin蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2、表1。

2.3 RT-PCR結(jié)果 模型組nephrin mRNA表達水平低于對照組、SE干預(yù)組和SE組，模型組desmin mRNA表達水平高于對照組、SE干預(yù)組和SE組（P＜0.05）；對照組和SE組、對照組和SE干預(yù)組中nephrin和desmin mRNA表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3、表2。

Figure 1 Expression of nephrin in four groups（immunofluorescence×200）圖1 4組nephrin表達情況（免疫熒光×200）

Figure 2 Expression of nephrin and desmin in 4 groups圖2 4組nephrin和desmin蛋白表達

Table 1 Comparison nephrin and desmin expression between 4 groups表1 4組nephrin和desmin蛋白表達水平比較（n=6，±s）

Table 1 Comparison nephrin and desmin expression between 4 groups表1 4組nephrin和desmin蛋白表達水平比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與（2）組比較，P＜0.05

組別對照組（1）模型組（2）SE干預(yù)組（3）SE組（4）F nephrin/β-actin 0.964±0.030a0.525±0.128 0.896±0.029a0.978±0.021a59.021＊＊desmin/β-actin 0.818±0.113a1.244±0.116 0.853±0.118a0.828±0.046a21.422＊＊

Figure 3 Renal mRNA expression of nephrin in 4 groups圖3 4組nephrin mRNA表達

Table 2 Comparison of nephrin and desmin transcription between 4 groups表2 4組nephrin和desmin mRNA表達水平比較（n=6s）

Table 2 Comparison of nephrin and desmin transcription between 4 groups表2 4組nephrin和desmin mRNA表達水平比較（n=6s）

＊＊P＜0.01；a與（2）組比較，P＜0.05

組別對照組（1）模型組（2）SE干預(yù)組（3）SE組（4）F nephrin/GAPDH 0.540±0.050a0.358±0.111 0.478±0.025a0.585±0.043a13.539＊＊desmin/GADPH 0.276±0.061a0.437±0.078 0.323±0.080a0.270±0.083a6.301＊＊

3 討論

3.1 nephrin在腎小球足細胞中的表達及意義 足細胞是腎臟固有細胞，有支持血管球參與基底膜合成、調(diào)控腎小球選擇通透性的作用。裂孔膜上某些蛋白表達或分布異?？芍伦阃蝗诤稀⒆慵毎麚p傷和脫落[4]。nephrin是裂孔膜上發(fā)現(xiàn)的第一種似黏附分子的跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，是公認的足細胞損傷相關(guān)分子，在多種腎臟疾病中異常表達。研究證實nephrin的表達減少與蛋白尿的發(fā)生有關(guān)，nephrin表達的改變是足細胞損傷的重要標志[5]。局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥（FSGS）患者表達最低，在足突融合區(qū)nephrin幾乎不表達。本課題組前期研究顯示，阿霉素腎病小鼠模型中nephrin表達下降，隨著病情進展，足細胞損傷持續(xù)加重，逐漸從腎小球基底膜上分離脫落，腎小球濾過屏障完整性遭到破壞，從而形成大量蛋白尿[6]。本實驗采用體外ADR誘導(dǎo)足細胞損傷模型，也證實了足細胞損傷后，nephrin的表達減少，與前期動物實驗結(jié)論一致。

3.2 desmin在腎小球足細胞中的表達及意義 desmin是足細胞骨架中間絲蛋白的一員，正常情況下，足細胞中較少表達，當各種原因?qū)е伦慵毎麚p傷時，可大量表達。Henderson等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠各種類型的足細胞損傷腎病模型中，腎小球desmin的表達顯著增高，認為desmin是足細胞損傷的標志性蛋白之一。足細胞損傷時desmin表達增加可能與足細胞肥大有關(guān)，desmin表達上調(diào)可以增加細胞對抗機械張力的能力[8]。本實驗通過ADR對體外培養(yǎng)足細胞的損傷發(fā)現(xiàn)，desmin蛋白水平和mRNA水平增加是足細胞損傷的敏感指標。

3.3 五味子在腎臟疾病中的應(yīng)用 五味子，五味具備，具有收斂固澀，補腎寧心之效，是一種開發(fā)前景廣闊的藥食兼用的傳統(tǒng)中藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，五味子有抗炎、抗氧化、清除氧自由基的作用[9]。其提取物的保護作用已經(jīng)被證實用于各種器官如肝臟、心臟、腎臟的損傷[10]。動物實驗證實，以五味子為君藥的中藥組方能有效減少糖尿病腎病和局灶性節(jié)段性腎小球硬化等模型的蛋白尿，減輕腎臟病變程度[11-12]。五味子提取物在干預(yù)大鼠腎的缺血再灌注模型中，可使血尿素氮、肌酐水平下降，提示五味子能清除氧自由基，抑制過氧化物產(chǎn)生，使腎組織細胞超微結(jié)構(gòu)及功能免遭破壞，對腎缺血再灌注損傷有保護作用[13]。本研究顯示，SE可以拮抗ADR對足細胞造成的損傷，通過比較免疫熒光、Western Blot和RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)SE干預(yù)組足細胞nephrin的表達較模型組增多，desmin的表達減少；其保護足細胞的具體機制尚未十分清楚，可能與SE通過上調(diào)nephrin和下調(diào)desmin的表達從而保護足細胞的完整性，進而保護腎臟功能有關(guān)。

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（2014-02-07收稿 2014-03-06修回）

（本文編輯 李鵬）

Effects of Schisandra Chinensis Fruit Ethanol Extract on Nephrin and Desmin Expression in Adriamycin Induced Podocyte Injury

AI Chen1，TAN Xiaoyue2，ZHANG Mianzhi3，ZHANG Daning4
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Medical School of Nankai University;3 Tianjin Police Hospital; 4 Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine

Objective To explore the effect of schisandra chinensis fruit ethanol extract on nephrin and desmin expression in adriamycin(ADR)induced podocyte injury in vitro.MethodsConditionally immortalized mouse podocytes were treated with ADR for 24 h in vitro,then the medium was changed to medium with SE（250 mg/L）for 24 h.Podocytes were divided into four groups:control group，model group,SE intervention group and SE group.The expression of nephrin in podocytes was detected by immunofluorescence.Western Blot was employed to assess nephrin and desmin expression.Transcription level of nephrin and desmin were determined by qRT-PCR.ResultsNephrin expression was distributed along the cell membrane in linear or granular pattern in control group and SE group.Fluorescence intensity in model group was lower than that of control group SE group and SE intervention group.There was no significant difference of nephrin and desmin protein and mRNA level between control group and SE group.Compared with the model group,protein and mRNA level of nephrin was lower than that of control group and SE intervention group.The protein expression and mRNA transcription of desmin in model group was higher than those in control group and SE intervention group(P＜0.05).ConclusionSE（250 mg/L）has no harmful effect on the podocytes in vitro.SE can protect the podocytes from damage by adriamycin in vitro.SE not only upregulate the expression of nephrin,but also down-regulate of desmin expression.

schisandraceae；podocytes；membrane proteins；adriamycin；nephrin；desmin

R692

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.004

*國家自然科學(xué)基金資助項目（項目編號：MSFC881150012）

1天津醫(yī)科大學(xué)（郵編300070）；2南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3天津市公安醫(yī)院；4天津市中醫(yī)藥研究院

△通訊作者 E-mail：zhangmianzhi@vip.sina.com