韓麗麗，楊 策，潘 賢，詹家綏，祝 雯

(福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福建 福州 350002)

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的一種毀滅性病害，自1845年第一次在愛爾蘭大爆發(fā)以后在世界馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，嚴(yán)重威脅著馬鈴薯的生產(chǎn)［1-3］。馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)的組成與變化直接影響著病害的發(fā)生與流行［4］。由于線粒體基因組與核基因組相比具有結(jié)構(gòu)簡單，單親遺傳和無組織特異性等特點，因此檢測線粒體多態(tài)性在晚疫病菌流行、遷移及群體遺傳結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的研究中具有重要作用［5，6］。

目前國內(nèi)外對于線粒體DNA(mtDNA)多態(tài)性的研究一般都是采用 PCR-RFLP［7，8］和核酸序列測定方法［9］。Griffith 和 Shaw［7］利用改進(jìn)的 PCR-RFLP 方法將線粒體單倍型分為Ⅰa，Ⅱa，Ⅰb，Ⅱb四種單倍型，目前國內(nèi)外對于馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA單倍型的檢測大多是采用這種方法。四種單倍型在世界的各國家和地區(qū)的分布情況不盡相同，Day等［10］檢測1995-1998年蘇格蘭，英格蘭，威爾士等地的馬鈴薯晚疫病菌的mtDNA只有Ⅰa和Ⅱa兩種單倍型，且Ⅰa占了91%。Winton等［11］對美國阿拉斯加的2007年的樣品進(jìn)行了單倍型分析，結(jié)果表明都為Ⅱa型。趙志堅等［12］對2001年云南馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA單倍型的研究發(fā)現(xiàn)云南群體也是Ⅰa型為主且Ⅰb型只出現(xiàn)在番茄寄主上。郭軍等［13］對于內(nèi)蒙古馬鈴薯晚疫病菌群體線粒體DNA單倍型的研究表明，內(nèi)蒙古群體的菌株均為Ⅱa型。通過對采集地馬鈴薯晚疫病菌群體mtDNA單倍型的檢測和鑒定，從而了解該地區(qū)晚疫病菌群體的分布和遷移替換情況。例如在歐洲通過mtDNA單倍型監(jiān)測表明，1845年馬鈴薯晚疫病菌的mtDNA單倍型為Ⅰa［14］，上世紀(jì)七十年代前，歐洲晚疫病菌群體主要是mtDNA單倍型為Ⅰb型，基因型為US-1的無性系［15-16］。上世紀(jì)七十年代中期開始Ⅰa，Ⅱa和Ⅱb逐漸取代Ⅰb型［17-19］。但2013年Kildea等報道在英國和愛爾蘭監(jiān)測到線粒體單倍型Ⅰb的出現(xiàn)，但其基因型不同于US-1［20］。晚疫病是限制我國馬鈴薯產(chǎn)量的重要因素，福建省屬于南方冬作區(qū)，目前沒有關(guān)于福建省近幾年晚疫病菌群體的線粒體DNA單倍型檢測的報道。本研究通過檢測福建省2010-2012年馬鈴薯主要栽培地區(qū)的晚疫病菌線粒體DNA單倍型，了解福建省馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)組成，為福建省晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試菌株是2010-2012年在馬鈴薯晚疫病菌發(fā)病期間，在福建省福州、長樂、漳州、青口、龍巖、龍海和霞浦七個地區(qū)進(jìn)行樣品采集并分離純化的馬鈴薯晚疫病菌菌株。采集時間和地點見表1。在發(fā)病區(qū)任選一塊田塊，隨機選擇發(fā)病植株，病株間隔2 m以上，每個病株上選擇單個病斑的病葉。無菌水沖洗葉片表面后，保濕培養(yǎng)12-24 h。用接種針挑取單根菌絲，接種于含有抗生素(氨芐青霉素100 μg/mL;利福平10 μg/mL)的選擇性黑麥培養(yǎng)基上，黑麥培養(yǎng)基配置是將20 g黑麥種子浸泡12 h，勻漿機粉碎，60℃水浴浸提3 h，四層紗布過濾，濾液定容至1 L，121℃高壓20 min，18℃避光培養(yǎng)7-10 d。純化的菌株接種于黑麥培養(yǎng)基培養(yǎng)，13℃避光長期保存菌株。

1.2 DNA提取和PCR-RFLP分析

收集在黑麥液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15 d的菌絲體冷凍干燥并粉碎后使用采用核酸提取試劑盒(GD2611，Biomiga)提取基因組 DNA。參考 Griffith和Shaw的方法［7］，采用引物 F1和R1，F(xiàn)2和R2分別擴(kuò)增線粒體基因的P1和P2片段，引物序列為F1:5'-GCAATGGGTAAATCGGCTCAA-3'，R1:5'-AAACCATAAGGACCACACAT-3';F2:5'-TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT-3'，R2:5'-TTACGGCGGTTTAGCACATACA-3'。PCR反應(yīng)體系:25 μL反應(yīng)體系，模板1 μL DNA，2.5 μL 10 × Buffer，1.0 unit Taq DNA polymerase，200 mmoL/L dNTP，10 pmol/L引物，2.5 mmol/L MgCl2，加無菌超純水補足至25 μL。PCR擴(kuò)增的程序為:94℃預(yù)變性90 s，94℃變性40 s，55℃退火60 s，72℃延伸90 s，40個循環(huán);72℃延伸5 min。

目的片段回收采用核酸回收試劑盒(DP214，天根生化試劑有限公司)進(jìn)行回收。對于擴(kuò)增的P1片段(引物為F1和R1)，使用CfoI酶切，對于擴(kuò)增的P2片段(引物為F2和R2)，使用MspI酶切，酶切體系為:10 × Buffer 2 μL，BSA 0.2 μL，酶 0.5 μL，回收的DNA 15 μL，補充超純水至20 μL。酶切的條件為37℃，2-3 h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照。

2 結(jié)果和分析

馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA單倍型劃分標(biāo)準(zhǔn)參照Griffith和Shaw提出的方法［7］。P1片段的長度為1118 bp(圖1)，若有CfoI酶的酶切位點，就會被酶切為211 bp和907 bp兩個片段;P2片段的長度為1070 bp(圖1)，可能被 MspI酶酶切為 350 bp和720 bp兩個片段，或是79 bp，350 bp和641 bp三個片段，或是147 bp，203 bp和720 bp三個片段。若被測樣本的P1片段被酶切為211 bp和907 bp，同時其P2片段被酶切為350 bp和720 bp兩個片段，那么此樣本的線粒體單倍型即為Ia型(圖2)。若被測樣本的P1片段被酶切為211 bp和907 bp，同時其P2片段被酶切為79 bp，350 bp和641 bp三個片段，那么此樣本的線粒體單倍型即為Ib型。若被測樣本的P1擴(kuò)增片段沒有CfoI酶的酶切位點，同時其P2片段被酶切為350 bp和720 bp兩個片段，那么此樣本的線粒體單倍型即為Ⅱb型(圖3)。若被測樣本的P1沒有CfoI酶的酶切位點，同時其P2片段被酶切為147 bp，203 bp和720 bp三個片段，那么此樣本的線粒體單倍型即為Ⅱa型(圖4)。

圖1 PCR產(chǎn)物P1和P2的檢測圖譜Fig.1 PCR products P1 and P2

圖2 線粒體Ⅰa單倍型的檢測圖譜Fig.2 Mitochondrial DNA haplotypesⅠa

圖3 線粒體Ⅱb單倍型的檢測圖譜Fig.3 Mitochondrial DNA haplotypesⅡb

圖4 線粒體Ⅱa單倍型的檢測圖譜Fig.4 Mitochondrial DNA haplotypesⅡa

利用F1/R1和F2/R2兩對引物分析了2010－2012年在福建省七個地區(qū)分離的526個馬鈴薯晚疫病菌株的單倍型組成和分布頻率(表1)，其中2010年包括福州37個，長樂35個，漳州32個菌株，2011年采集的霞浦91個菌株，2012年采集菌株包括龍巖114個菌株，青口76個菌株和龍海46個菌株，霞浦95個。在526個菌株中共檢測出三種單倍型:I a，Ⅱa和Ⅱb。沒有檢測到Ⅰb型。頻率最高的為Ia型，占 72.8%，其次為Ⅱb型為 139個菌株，占26.42%。Ⅱa型占0.76%，分別來自青口1個，福州1個，漳州2個。龍巖采樣點的菌株全部為Ⅱb型，而其他幾個群體均以Ia為主要單倍型，頻率均在85%以上。龍海、霞浦和長樂都有Ia和Ⅱb兩種單倍型，青口有Ia和Ⅱa兩種單倍型，福州有三種單倍型(Ⅰa、Ⅱa和Ⅱb)。通過卡方檢驗得到卡方值為416.85，自由度為14，P ＜0.001。說明這些群體間線粒體單倍型的分布差異極顯著。

表1 福建省馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA單倍型及其分布頻率Tab.1 Identity and distribution frequencies of the mitochondrial DNA haplotypes in Fujian province

3 討論

馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA結(jié)構(gòu)比較簡單和單親遺傳特點，使其成為研究馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳理想研究對象。利用PCR-RFLP方法可將馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA共劃分為4個mtDNA單倍型，即:Ia，Ib，Ⅱa和Ⅱb［7］。本文分析了 2010 －2012 年從福建省分離純化的馬鈴薯晚疫病菌8個群體，共526個馬鈴薯晚疫病菌株。結(jié)果表明福建省含有三種線粒體單倍型，以Ia型為主，占72.8%，其次為Ⅱb型為139個菌株，占26.42%。Ⅱa型占0.76%。群體間線粒體單倍型的分布差異極顯著(P＜0.001)。Li等對1998－2006年的108個分離自福建的致病疫霉菌株分屬于Ib、Ⅱa和Ⅱb三個單倍型，其中103個菌株為Ⅱb，占被測菌株95.4%，為福建優(yōu)勢線粒體DNA單倍型群體［21］。以上結(jié)果表明福建省馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)發(fā)生很大的變化。1997－1999年和2002－2003年采自內(nèi)蒙古馬鈴薯栽培區(qū)的40個馬鈴薯晚疫病菌株的線粒體DNA單倍型分析表明均為Ⅱa型［13］。2006－2007年采自青海不同地區(qū)的70個晚疫病菌材料的線粒體單倍型中94.3%的菌株為Ⅱa，5.7%的菌株為Ⅱb型，且Ⅱb型均分離自番茄［22］。2008－2011年采集自四川的192個馬鈴薯晚疫病菌中有Ia和Ⅱa兩種單倍型，分別占測定菌株的97.4%和2.6%，Ⅰa單倍型馬鈴薯晚疫病菌廣泛分布于四川各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)［23］。在寧夏固原的94株供試菌株中，線粒體單倍型均為Ia型［24］。趙志堅等對2001年云南馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA單倍型的研究發(fā)現(xiàn)云南群體也是Ia型為主，且Ib型只出現(xiàn)在番茄寄主上［12］。從以上文獻(xiàn)研究結(jié)果分析表明福建省的線粒體單倍型與寧夏、云南和四川省都以Ia型為主，但福建省的線粒體單倍型組成比其他地區(qū)復(fù)雜。其原因可能福建是馬鈴薯種薯輸入省，除了農(nóng)戶自留種，每年都從北方和周邊主產(chǎn)區(qū)調(diào)入大量的種薯。在調(diào)入種薯的同時，一些新的不同線粒體單倍型的晚疫病菌也跟著被帶進(jìn)福建，因此福建馬鈴薯種植面積較小，但致病疫霉群體的線粒體單倍型組成相對較復(fù)雜。

本研究初步分析了福建省馬鈴薯晚疫病菌的線粒體的單倍型組成和頻率分布，下一步將對福建省不同地區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌群體進(jìn)行更全面的群體遺傳分析，探討該病原物的群體遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化機制，為制定長效和生態(tài)友好型的晚疫病防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

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