王利群，唐冬英，李新梅，段桂芳，吳 丹，趙小英，劉選明

(湖南大學(xué)生物學(xué)院植物基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410082)

泛素是由76個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能夠通過泛素化途徑特異性的結(jié)合目標(biāo)蛋白和賴氨酸殘基［1，2］。早期泛素化途徑需要三種酶的共同作用:E1(泛素活酶)，E2(泛素結(jié)合酶)和E3(泛素連接酶)。在擬南芥中有2個(gè)E1s，至少37個(gè)E2s和1400多E3s。在植物中，E3泛素連接酶由不同的基因編碼。E3既能通過單個(gè)亞基也能形成多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物行使泛素化功能［3，4］。根據(jù)與 E2綁定結(jié)構(gòu)域的不同，單亞基的E3可以進(jìn)一步分為含有HECT結(jié)構(gòu)域和RING/U-box結(jié)構(gòu)域的E3，它們具有不同的泛素傳輸機(jī)制［5］。HECT類E3是一個(gè)含有350個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，同時(shí)包含泛素結(jié)合域和E2綁定結(jié)構(gòu)域。在擬南芥基因組中，HECT是E3蛋白家族中最小的亞家族，只有七個(gè)成員［6］。含RING結(jié)構(gòu)域的E3大約有477個(gè)亞家族蛋白成員。

SCF復(fù)合體是由多亞基構(gòu)成的E3連接酶，是植物體內(nèi)數(shù)目最多，最具特點(diǎn)的E3家族蛋白［7］。SCF復(fù)合體由四個(gè)亞基組成:SKP1(在擬南芥中簡稱為ASK)，Cullin1(CUL1)，F(xiàn)-box 蛋白和RBX1［3］。在SCF復(fù)合體中，Cullin作為支架，它的 C-末端結(jié)合RBX1，N-末端結(jié)合SKP1。反過來SKP1蛋白與F-box結(jié)構(gòu)域相互作用，在F-box蛋白的N-末端形成一個(gè)完整的SCF復(fù)合體［8］。F-box蛋白C-末端含有蛋白與蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域，包括WD-40，KELCH和LRR(富含亮氨酸的重復(fù)域)。在擬南芥中，F(xiàn)-box蛋白家族由超過700個(gè)基因編碼［9］，表明在植物中泛素化介導(dǎo)的蛋白降解這個(gè)過程是調(diào)節(jié)生長發(fā)育的重要過程。有研究報(bào)道，F(xiàn)-box基因參與調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育的各個(gè)方面，包括激素受體和信號(hào)傳導(dǎo)［3，10，11］，對(duì)光相關(guān)的響應(yīng)［12］，花的發(fā)育［4，12］，自交不親和［4，6］，表觀遺傳調(diào)控［6］，植物發(fā)病機(jī)理及疾病控制［6］，植物逆境脅迫反應(yīng)［13，14］等。例如:在番茄中，抑制SlFbf的表達(dá)，導(dǎo)致花粉和種子變大，表明SlFbf的能調(diào)節(jié)雄蕊發(fā)育而影響受精［15］;F-box基因FOA1參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)擬南芥種子萌發(fā)、氣孔開放、和根的生長［16］。

擬南芥At5g22700基因位于第五條染色體上，含有F-box，LRR和FBD結(jié)構(gòu)域，是F-box蛋白家族成員，其功能未知。本研究檢測(cè)了At5g22700蛋白與ASK家族蛋白的相互作用、該基因在不同組織器官中的表達(dá)。以T-DNA插入突變體和構(gòu)建的過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥為材料，初步分析了At5g22700基因在植物生長發(fā)育中的功能，為全面了解植物F-box基因家族功能提供生物學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長條件

本研究所采用的擬南芥野生型為Col-4和Col-0，T-DNA插入突變體salk060937和salk009942是從擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)購買的，其遺傳背景為Col-0。將植物種在長日照條件下，溫度為22±4℃。在植物生長的成年期取根、莖、葉、花和果莢，立即放入液氮，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 T-DNA插入突變體鑒定 取T-DNA插入突變體salk060937和salk009942植物葉片，提取基因組DNA，然后采用“三引物法”即采用三個(gè)引物(LP:T-DNA插入點(diǎn)左邊界引物;RP:插入點(diǎn)右邊界引物;R0為Signal提供的一條位于T-DNA插入序列左邊界用于鑒定的引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以基PCR程序?yàn)?94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72 ℃1 min，30個(gè)循環(huán)，后延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。引物序列為:salk060937-LP5'-GAGAATGAGGCAGTGCTCAAG-3;salk060937-RP5'-ATGCATCACCTTGAGATTTGG-3';salk009942-LP 5'-TCACCGGTTCT AATGGAACAG-3';salk009942-RP5'-AGTGCCAAAGTGTTTGCAATC-3';R05'-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3'。

1.2.2 RNA表達(dá)分析 采用 RNAeasy Mini Kit(TaKaRa)試劑盒提取總RNA，然后用Maxima? First Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒合成cDNA。將cDNA稀釋10倍后用于RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

半定量 RT-PCR分析:取2 μL稀釋的 cDNA在20 μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，程序?yàn)?95℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。持家基因ACTIN2的PCR產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR引物序列為:At5g22700-RT-F 5'-TACATTCGTCAGTTTCGCCTCT-3';At5g22700-RT-R 5'-CCTAGAGCGCACCCGTAA-3';ACTIN2-RT-F 5'-CACTGTGCCAATCTACGAGGG T-3';ACTIN2-RT-R 5'-CACAAACGAGGGCTGGAA-CAAG-3'。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR:采用SYBR? Green I試劑盒(東盛公司)，取1 μL稀釋10倍的 cDNA作為模板，在 Mx3000P(Stratagene)定量 PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 10 min;95℃ 30 s;55℃30 s;72℃ 30 s;45個(gè)循環(huán)。以ACTIN2為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。定量 PCR引物為序列為:At5g22700-QF 5'-AGCGTTATGTGATGAAAGTAGCA-3'，At5g22700-QR 5'-CGCAGTCCACGAACCTCTAT-3'。ACTIN2-QF:5'-CACTGTGCCAATCTACGAGGG T-3'ACTIN2-QR 5'-CACAAACGAGGGCTGGAACA AG-3'。

1.2.3 At5g22700基因植物表達(dá)載體及酵母表達(dá)載體構(gòu)建 以野生型擬南芥cDNA為模板，進(jìn)行Gateway克隆擴(kuò)增。利用primer5軟件設(shè)計(jì)特異性引物:At5g22700-F:5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCAACCGAGGAGATAGG-3'和At5g22700-R:5'-CAAGAAAGCTGGGTCTATATCCAAGACAGGGGTTGAAA-3'，以 及 At5g22700N48-F:5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCAACCGAGGAGATAGG-3'和At5g22700 N48-R:5'-CAAGAAAGCTGGGTCTATATCCAAGACAGGG GTTGAAA-3'(下劃線序列為attB位點(diǎn))，分別用于克隆At5g22700基因的CDS序列和F-box結(jié)構(gòu)域。利用prime STAR高保真酶(TaKaRa)，通過PCR反應(yīng)獲得帶有attB位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝聚電泳回收目的條帶，利用BP ClonaseⅡ(invitrogen)經(jīng)BP重組反應(yīng)將其克隆到入門載體pDONR/ZEO。測(cè)序正確后，利用LR ClonaseⅡ(invitrogen)將At5g22700基因的CDS序列克隆到植物表達(dá)載體pEarleyGate 203(N-Myc)中，將F-box結(jié)構(gòu)域片段克隆到酵母表達(dá)載體pDEST32中，獲得重組質(zhì) 粒 pEarleyGate203-At5g22700和 pDEST32-At5g22700N48分別用于植物轉(zhuǎn)化和酵母雙雜交分析。

將獲得的pEarleyGate 203-At5g22700重組質(zhì)粒經(jīng)電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，然后采用浸花蕾的方法［17］轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)基因擬南芥經(jīng)除草劑Basta篩選獲得純合子。收集純合子株系的葉片，液氮速凍后，于-80℃保存用于RNA提取和基因表達(dá)分析。

1.2.4 酵母雙雜交及X-Gal顯色 參照PT3024-1手冊(cè)，將獲得的重組質(zhì)粒pDEST32-At5g22700N48(編碼At5g22700和GAL4 DNA綁定域的融合蛋白)，將其轉(zhuǎn)入Y187酵母中，隨后與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的 pDEST22-ASK(ASK1，2，3，4，5，6，7，8，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，21)酵母庫 AH109 進(jìn)行融合培養(yǎng)，然后涂布在含SD/-Leu/-Try的固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2-3天。挑取2-3個(gè)克隆混勻后涂布在含SD/-Leu/-Try/-His的固體培養(yǎng)基上，篩選與At5g22700N48蛋白相互作用的ASK蛋白。隨后用濾紙印跡顯色法檢測(cè)檢測(cè)長出的菌落的β-半乳糖苷酶活性，從而確定At5g22700N48與ASK蛋白的相互作用。Z buffer/X-Gal顯色液為:100 mL Z buffer，0.27 mL β-mercaptoethanol，1.67 mL 20 mg/mL X-gal solution。Z buffer溶液為:Na2HPO47H2O 16.1 g/L，NaH2PO4H2O 5.50 g/L，KCl 0.75 g/L，MgSO47H2O 0.246 g/L，pH 7.0。

1.2.5 擬南芥根長度測(cè)定 擬南芥種子經(jīng)1%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗5次后，懸浮于0.1%的瓊脂糖溶液中，然后播種于MS培養(yǎng)基中，分別放置在黑暗、藍(lán)光(80 μmol m-2s-1)、紅光(50 μmol m-2s-1)、遠(yuǎn)紅光(10 μmol m-2s-1)下培養(yǎng)7 天，對(duì)幼苗進(jìn)行拍照，并測(cè)量至少20株幼苗主根的長度進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 At5g22700蛋白的F-box結(jié)構(gòu)域與ASK蛋白家族成員的相互作用分析

利用NCBI網(wǎng)站提供的連接Proteins Conserved Domain Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，對(duì) At5g22700蛋白的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白的 N端存在一個(gè)F-box結(jié)構(gòu)域，C端具有一個(gè)可能參與蛋白相互作用的LRR結(jié)構(gòu)域，以及可能具有轉(zhuǎn)錄因子活性的FBD結(jié)構(gòu)域(圖1A)，表明At5g22700是F-box蛋白家族的一個(gè)成員。

為確認(rèn)F-box蛋白At5g22700是否為SCF復(fù)合物成員，采用酵母雙雜交檢測(cè)了At5g22700蛋白的F-box結(jié)構(gòu)域與擬南芥ASK家族成員的相互作用。首先，以擬南芥野生型cDNA為模板，通過PCR克隆得到F-box結(jié)構(gòu)域，即At5g22700N48編碼序列片段。采用Gateway技術(shù)將At5g22700N48片段克隆到 pDEST32載體中與BD形成融合蛋白，并轉(zhuǎn)入酵母Y187中。將該酵母與轉(zhuǎn)入pDEST22-ASK酵母庫AH109進(jìn)行融合培養(yǎng)1天后，分別涂布在含有不同濃度3-AT的SD/-Leu/-Try/-His固體培養(yǎng)基上。酵母雙雜交結(jié)果顯示，pDEST32-At5g22700N48和pD-EST22-ASK4共培養(yǎng)酵母在含不同濃度3-AT的SD/-Leu/-Try/-His培養(yǎng)基上均能夠繼續(xù)生長，其他酵母的生長明顯受到抑制(圖1B)，初步說明At5g22700N48與ASK4有相互作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證At5g22700 N48與ASK4的相互作用，采用X-Gal顯色實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。濾紙顯色結(jié)果顯示，pDEST32-At5g22700N48和 pDEST22-ASK4共培養(yǎng)酵母在加Z buffer/X-Gal顯色液后2小時(shí)變藍(lán)，陰性對(duì)照則沒有變藍(lán)(圖1C)，表明At5g22700蛋白的F-box結(jié)構(gòu)域與ASK4存在相互作用。因此，推測(cè)At5g22700可能是SCF復(fù)合物的成員。

圖1 At5g22700蛋白F-box結(jié)構(gòu)域At5g22700N48與ASK蛋白家族成員相互作用的酵母雙雜交分析Fig.1 Yeast two-hybrid analysis of interaction between At5g22700N48and ASK protein family

2.2 At5g22700基因在擬南芥不同組織器官中的表達(dá)分析

基因的組織器官表達(dá)特異性為預(yù)測(cè)和研究其生物學(xué)功能提供參考信息。為研究該基因在不同組織器官的表達(dá)情況，收集野生型擬南芥成熟植株的根、莖、蓮座葉、莖生葉、花及果莢，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。從圖2中可看出，該基因在擬南芥各個(gè)組織器官中均有表達(dá)，其中根和花中的表達(dá)量相對(duì)較高，莖中的表達(dá)量較低，說明該基因可能在根和花的生長發(fā)育過程中起作用。

2.3 At5g22700基因T-DNA插入突變體及轉(zhuǎn)基因株系分子鑒定

圖2 At5g22700基因在擬南芥不同組織器官中表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR分析Fig.2 Real time PCR analysis for At5g22700 gene expression in different organs in Arabidopsis

為了進(jìn)一步分析At5g22700基因的生物學(xué)功能，從ABRC購買T-DNA插入突變體salk060937和salk009942。T-DNA插入位點(diǎn)分別在基因起始密碼子的下游500 bp和1891 bp的外顯子中(圖3 A)。采用三引物法對(duì)T-DNA突變體進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示株系 salk060937-1、salk060937-2、salk009942-1、salk009942-2、salk009942-3都為純合子(圖3B)。隨后，采用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了salk060937-1和salk009942-1株系中At5g22700基因的表達(dá)量。從圖3中可看出，該基因在突變體中的表達(dá)量明顯降低 (圖2C，D)，說明T-DNA插入破壞了At5g22700基因的正常表達(dá)，可用于隨后的表型分析實(shí)驗(yàn)。

此外，我們將At5g22700基因的CDS序列克隆到植物表達(dá)載體pEarleyGate 203中，獲得pEarleyGate 203-At5g22700重組質(zhì)粒，通過植物轉(zhuǎn)化和Basta篩選獲得了At5g22700轉(zhuǎn)基因純合子植株。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，At5g22700ox-1和At5g22700ox-2轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)At5g22700基因的mRNA表達(dá)水平明顯升高，分別為野生型中的80倍和160倍，表明這兩個(gè)株系均為At5g22700過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。

2.4 At5g22700過量表達(dá)或者缺失表達(dá)對(duì)擬南芥幼苗主根伸長的影響

根據(jù)上述組織器官表達(dá)結(jié)果，我們推測(cè)At5g22700可能參與植物根和花的發(fā)育。因此以At5g22700過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥及T-DNA插入突變體為材料，分析了At5g22700的功能。首先，將擬南芥播種在土壤中，培養(yǎng)在長日照條件下觀察開花時(shí)間及花的形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些植株并沒有表現(xiàn)出特異表型。隨后，將擬南芥種子播種在MS固體培養(yǎng)基上，放置在黑暗、藍(lán)光、紅光或者遠(yuǎn)紅光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)表型觀察和統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)藍(lán)光下At5g22700過量表達(dá)突變體的主根比野生型長，黑暗、白光、紅光和遠(yuǎn)紅光條件下主根長度與野生型之間無明顯差異(圖4)，說明該基因過量表達(dá)導(dǎo)致幼苗的下根變長，并且具有藍(lán)光特異性。但是，所有光照條件下，T-DNA插入突變體的根與野生型之間無差異，這說明該基因與同源基因之間可能存在功能冗余現(xiàn)象，這還有待于進(jìn)一步研究。

圖3 T-DNA插入突變體及過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的分子鑒定Fig.3 Molecular Identification of T-DNA insertion mutants and transgenic lines

3 討論

F-box蛋白通常通過其F-box結(jié)構(gòu)域與Skp1(在擬南芥中簡稱為ASK)相互作用，與Cullin、RBX1共同構(gòu)成SCF復(fù)合物。在擬南芥中存在21個(gè)ASK基因家族成員［18］，F(xiàn)-box蛋白可能與其中1個(gè)或者多個(gè)ASK相互作用［19］，如 F-box蛋白 DOR與 ASK4相互作用［20］，EDL3 與 5個(gè) ASK 蛋白包括 ASK1、ASK2、ASK4、ASK11 和 ASK18 相互作用［21］，COI1(CORONATINE INSENSITIVE1)與 ASK1 相 互 作 用［22］，At3g16740與ASK11相互作用［23］。在本研究中，通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)At5g22700蛋白的F-box結(jié)構(gòu)域與ASK4具有較強(qiáng)的相互作用(圖1B，C)，但是At5g22700全蛋白與本實(shí)驗(yàn)中所用的16個(gè)ASK蛋白家族成員間無相互作用(圖片沒有列出)，這可能是由于At5g2700全蛋白在酵母中形成的空間結(jié)構(gòu)阻礙了F-box結(jié)構(gòu)域與ASK4蛋白的結(jié)合。At5g2700蛋白在植物中是否與ASK4相互作用還需進(jìn)一步研究。

圖4 不同光照條件下At5g22700過量表達(dá)或者缺失表達(dá)擬南芥幼苗的表型分析Fig.4 Root Phenotype of At5g22700-overexpressing plant and T-DNA insertion mutant in different light condition

通過分析基因在植物不同組織器官的表達(dá)可為預(yù)測(cè)基因的功能提供線索［24］。本研究發(fā)現(xiàn)該基因在擬南芥各個(gè)組織器官中都有表達(dá)，其中根和花中的表達(dá)最高，推測(cè)該基因可能參與植物花和根的發(fā)育調(diào)控。At5g2700過量或者缺失表達(dá)對(duì)開花無影響，但是過量表達(dá)導(dǎo)致擬南芥幼苗根變長，缺失表達(dá)對(duì)根的伸長則無影響，說明該基因調(diào)控?cái)M南芥主根伸長，并可能存在功能冗余現(xiàn)象。

本研究中最有趣的現(xiàn)象是，At5g2700對(duì)幼苗根伸長的促進(jìn)作用具有藍(lán)光特異性。有研究報(bào)導(dǎo)在擬南芥中，藍(lán)光受體cry1和cry2調(diào)節(jié)主根的生長［25］，表明At5g2700可能通過藍(lán)光信號(hào)途徑調(diào)節(jié)根的伸長，這種假設(shè)還需要進(jìn)一步的研究。

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