李 進(jìn)，賀菁菁，林 戈，盧光琇*

(1.中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410078;2.人類國(guó)家干細(xì)胞工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410078)

人胚胎干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能，在體外內(nèi)能經(jīng)由限定性內(nèi)胚層細(xì)胞，原始腸管，誘導(dǎo)分化獲得胰腺前體細(xì)胞。經(jīng)歷原始腸管尾端化以后，隨后的細(xì)胞類型的特化并不是隨機(jī)進(jìn)行的，某些特定信號(hào)如RA信號(hào)及BMP信號(hào)調(diào)控調(diào)控細(xì)胞朝著肝臟、胰腺、消化道等多個(gè)人體重要的組織器官分化。FGF10在胚胎胰腺間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，作為微環(huán)境能有效的促進(jìn)胰腺上皮細(xì)胞的增殖［1，2］。IndolactamV是蛋白激酶C同工酶的抑制劑，最近研究發(fā)現(xiàn)它能增加表達(dá)pdx1基因的胰腺原基細(xì)胞數(shù)目［3］。并且聯(lián)合 indolactamV和 FGF10能提高 pdx1陽性細(xì)胞的比率［2］。在原始腸管階段后，BMP信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞向肝臟的進(jìn)一步分化［4］，所以想要獲得更多的胰腺前體細(xì)胞，抑制BMP信號(hào)是有效的方式，dorsomorphin是通過阻斷BMP調(diào)節(jié)SMAD1/5/8磷酸化起到抑制BMP信號(hào)的作用，文獻(xiàn)報(bào)道能有效地抑制BMP信號(hào)通路促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)［5］。有研究表明RA信號(hào)在胚胎內(nèi)胚層向早期胰腺發(fā)育中起著重要作用，因此RA用于胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)策略中。在小鼠ES細(xì)胞誘導(dǎo)中，在EB形成的D4加入RA能促進(jìn)內(nèi)胚層細(xì)胞的定向分化［6］。Noggin，RA和FGF協(xié)調(diào)作用可以調(diào)節(jié)內(nèi)胚層向肝胰分化［7］。另外，Actinvin A聯(lián)合RA作用通過三步法可以獲得胰島素分泌細(xì)胞［8］，上述研究顯示 RA在胰腺的內(nèi)胚層的決定和胰腺誘導(dǎo)中起到重要作用，目前對(duì)于RA誘導(dǎo)的最佳開始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間尚無明確報(bào)道;因此了解最佳的RA作用時(shí)期，是限定性內(nèi)胚層向胰腺前體細(xì)胞誘導(dǎo)策略中的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)利用自主建系的人胚胎干細(xì)胞系為材料，研究RA在限定性內(nèi)胚層向胰腺前體細(xì)胞分化過程中的最佳作用時(shí)間窗，為深入研究人胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為更成熟的胰島素分泌細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

chHES137，chEHS26 為本實(shí)驗(yàn)室自主建系［9］，核型正常，P20～P30用于實(shí)驗(yàn)。CF1成纖維細(xì)胞做為飼養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12，15%SR、0.1 mmol/L β-ME、2 mmol/L L-Glu、4 ng/mL bFGF、1%非必需氨基酸。細(xì)胞每5-7天傳代一次，用于實(shí)驗(yàn)的人胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)到Matrigel預(yù)鋪皿的培養(yǎng)板上，使用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，生長(zhǎng)3-5天后開始誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

1.2 誘導(dǎo)因子

試驗(yàn)中用的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子如下:DMEM/F12、FBS、RPMI1640為 Invitrogen公司產(chǎn)品，Activin A、Wnt3a、KGF、FGF10購(gòu)自 R＆D 公司;dorsomorphin、indolactamV購(gòu)自Stemgent公司;AFP單克隆抗體購(gòu)自sigma公司、PDX1單克隆抗體購(gòu)自 R＆D公司;RA(視黃酸)購(gòu)自sigma公司。

1.3 胰腺前體細(xì)胞誘導(dǎo)

從人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)獲得胰腺前體細(xì)胞分為三個(gè)階段，第一階段為限定性內(nèi)胚層細(xì)胞的誘導(dǎo)(d0-d3)，在無飼養(yǎng)層體系上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞匯合度到80%左右開始實(shí)驗(yàn)，用DPBS洗2遍，換RPMI1640培養(yǎng)基，添加100 ng/mL ActivinA(A)和25 ng/mL Wnt3a(W)共同作用一天，接下來ActivinA持續(xù)作用2天誘導(dǎo)限定性內(nèi)胚層細(xì)胞［10］。第二階段為原始腸管細(xì)胞誘導(dǎo)(d3-d6)，添加25 ng/mL KGF和2%FBS作用3天獲得原始腸管細(xì)胞［11］。第三階段為胰腺前體細(xì)胞的分化(d6-d10)，聯(lián)合 FGF10、dorsomorphin(Dor)、indolactamV(ILV)共同作用4天誘導(dǎo)胰腺前體細(xì)胞。根據(jù)RA的作用時(shí)間窗口，RA的作用方式分為四個(gè)組:不加RA組，d3-d6加RA組;d6-d10加RA組;以及d3-d10加RA組。

1.4 免疫熒光染色

收集不同實(shí)驗(yàn)組的在d10天的細(xì)胞，進(jìn)行pdx1和afp抗體的免疫熒光染色，并用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。方法如下:收集的細(xì)胞用PBS快速清洗三遍，加4%的多聚甲醛溶液室溫下固定細(xì)胞15 min，加PBS清洗3遍;加封閉液(PBS中添加10%驢血清、0.1%的triton-X-100和1%BSA)封閉30 min，加 PBS清洗3遍;加一抗(小鼠抗人AFP單克隆抗體，1∶500稀釋;山羊抗人PDX1單克隆抗體，1∶200稀釋)，4℃過夜孵育，次日加PBS清洗3遍;加熒光二抗(驢抗羊A-lexis 594，1∶1000;驢抗小鼠 Alexis 488，1∶1000)室溫避光孵育1 h，用 PBS清洗3遍;加 DAPI(1∶1000稀釋)染核，室溫避光孵育5 min，用PBS清洗3遍;熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù):隨機(jī)選取10個(gè)顯微鏡視野，平均每個(gè)視野下約200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)2000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞總數(shù)和比例。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，所有的結(jié)果重復(fù)三次。

1.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

收集誘導(dǎo)各個(gè)階段的細(xì)胞以及RA不同處理組在d10天的細(xì)胞，使用TRIZOL試劑(invitrogen)抽提總RNA，并用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)合成cDNA，起始的總RNA定量到1 μg，所有的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)都使用Tag DNA聚合酶，在不同的反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)下，總的反應(yīng)體系為10 μL，PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上分離并用溴化乙錠染色。引物序列和對(duì)應(yīng)基因片段大小請(qǐng)見表1。

表1 RT-PCR的引物序列Tab.1 Primers for RT-PCR

2 結(jié)果

2.1 人胚胎干細(xì)胞向胰腺前體細(xì)胞分化體系的建立

Pdx1作為胰腺前體細(xì)胞特有標(biāo)記［12］，可以用來指示胰腺的特化。經(jīng)歷原始腸管后，聯(lián)合FGF10、dorsomorphin、indolactamV共同作用4天誘導(dǎo)胰腺前體細(xì)胞，在d10天免疫組化結(jié)果顯示，三個(gè)因子共同作用能獲得pdx1陽性細(xì)胞，但是同時(shí)也獲得了AFP陽性細(xì)胞，并且兩種標(biāo)記的并不重合(圖1)。RTPCR結(jié)果顯示在限定性內(nèi)胚層階段和原始腸管階段均沒有pdx1和afp的表達(dá);而在胰腺特化4天后，誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞開始表達(dá)pdx1和afp。AFP作為早期肝臟前體細(xì)胞的標(biāo)記，以上結(jié)果說明在獲得胰腺前體細(xì)胞的同時(shí)，也有部分細(xì)胞朝著肝臟前體細(xì)胞特化。

2.2 RA持續(xù)作用能有效的促進(jìn)pdx1表達(dá)并且同時(shí)抑制afp表達(dá)

為了了解RA能否增強(qiáng)pdx1的表達(dá)以及能否抑制AFP的表達(dá)，d10天檢測(cè)4組細(xì)胞的pdx1和AFP結(jié)果顯示，就pdx1陽性比率而言，結(jié)果為d3-d10RA組＞d6-d10RA組 ＞NO RA組 ＞d3-d6RA組;對(duì)于afp的陽性比率，NO RA組＞d6-d10RA組＞d3-d6RA組＞d3-d10RA組(圖2);兩者的結(jié)果說明RA的引入并在d3到d10天持續(xù)作用，在促進(jìn)pdx1表達(dá)的同時(shí)并且能同時(shí)抑制afp的表達(dá)，能更加有效的促進(jìn)內(nèi)胚層前體細(xì)胞向胰腺前體細(xì)胞分化。RT-PCR檢測(cè)pdx1和afp在四組中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與免疫組化技術(shù)的結(jié)果有相似的趨勢(shì)，RA持續(xù)作用組可以獲得最高的pdx1和最低的afp基因表達(dá)(圖3)。

圖1 誘導(dǎo)10天后檢測(cè)pdx1(紅色)和afp(綠色)的表達(dá)Fig.1 The expression of pdx1(red)and gfp(green)on d10 in pancreatic precursor induction

2.3 RA持續(xù)作用條件下，RA作用到d9天是最佳的作用時(shí)間

圖2 RA不同作用時(shí)間下在d10天pdx1和afp陽性細(xì)胞比率變化趨勢(shì)圖Fig.2 Trend line chart of percentage of pdx1 and afp positive cells in different groups on d10

圖3 不同RA作用組在d10天pdx1和afp檢測(cè)的RT-PCR結(jié)果Fig.3 The expression of pdx1 and afp on d10 in different groups by RT-PCR

既然RA在d3到d10持續(xù)作用能有效的促進(jìn)pdx1的表達(dá)，那么是什么樣的胰腺前體細(xì)胞最適合用于朝向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化。我們分別在持續(xù)作用組的d7;d8;d9;d10四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過免疫組化檢測(cè) pdx1的陽性比率(圖 3)。結(jié)果顯示，d9(52.1±1.2%)＞d8天(46.3±1.9%)＞d10天(40±1.3%)＞d7天(37±1.8%);pdx1的表達(dá)經(jīng)歷了由d7到d9天的上升過程，從d9到d10pdx1的表達(dá)開始減弱，在誘導(dǎo)的d9天達(dá)到峰值，也就是說在d9天能獲得最多的胰腺前體細(xì)胞，所以d9也是由胰腺前體細(xì)胞朝向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的最佳時(shí)間點(diǎn)。

3 討論

人胚胎干細(xì)胞向胰腺前體細(xì)胞以及胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，過程中需要像 Wnt，shh和 EGF［13-15］等很多的信號(hào)分子分階段參與調(diào)控。聯(lián)合FGF10、dorsomorphin、indolactam V共同作用4天可以獲得同時(shí)pdx1和afp陽性細(xì)胞，而且兩者的染色結(jié)果并不重疊。說明內(nèi)胚層前體細(xì)胞同時(shí)啟動(dòng)了向胰腺前體和肝臟前體的分化，BMP信號(hào)參與到胰腺和肝臟前體細(xì)胞的調(diào)控分化［16］。因此我們?cè)谧非笠认偾绑w陽性細(xì)胞比率的同時(shí)還需要抑制內(nèi)胚層細(xì)胞在這一過程向其他類型細(xì)胞分化，顯然單獨(dú)的dorsomorphin抑制BMP的表達(dá)并沒有完全起到這樣的效果。

早期研究關(guān)注RA能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的成熟和抑制細(xì)胞增殖［17］。在非洲蟾蜍上的研究顯示RA在原腸形成的過程中調(diào)節(jié)內(nèi)胚層的形成［18，19］。不只是在內(nèi)胚層特化過程中，RA在向胰腺特化過程中起著重要作用［20］，RA能有效的促進(jìn)pdx1陽性細(xì)胞的比率［21］。所有結(jié)果顯示RA在內(nèi)胚層特化和胰腺前體特化過程中都起到作用。也有研究表明RA在胰腺特化過程中能起到抑制AFP的作用［22］。因此在限定性內(nèi)胚層細(xì)胞向胰腺前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，RA到底需要以什么樣的方式起作用才能效果最佳值得探討。結(jié)果中，從內(nèi)胚層開始到胰腺前體細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，只有RA一直作用才能有效的促進(jìn)pdx1的表達(dá)并抑制afp的表達(dá)，并且在作用的d9天能取得最高比率的pdx1陽性細(xì)胞。這一結(jié)果和前面在模式生物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，說明人胚胎干細(xì)胞在體外能夠較好的重復(fù)體內(nèi)發(fā)育過程。因此通過在體外模擬胰腺β細(xì)胞發(fā)育規(guī)律最終獲得胰島素陽性細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞能作為治療糖尿病的理想的種子細(xì)胞。

圖4 RA持續(xù)作用條件下pdx1陽性細(xì)胞比率在不同時(shí)間點(diǎn)變化情況Fig.4 The expression of percentage of pdx1 positive cells at different time with RA

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