陳 睿,陳 輝,雷 燕*,馬淑驊,王 毅*
(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,北京 100700;2.北京急救中心,北京 100031)
光波入射各向異性的物質(zhì)后,都要發(fā)生雙折射(除特殊方向以外),分解為振動(dòng)方向互相垂直,傳播速度不同,折射率不等的兩束偏振光波,物質(zhì)的這種屬性,被稱(chēng)為雙折光性[1]。雙折射是樣品的分子排列的本質(zhì)屬性,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,能產(chǎn)生雙折光性的物質(zhì)有纖維(如膠原纖維、肌纖維、彈性纖維)、紡錘體、骨頭、牙齒等。實(shí)驗(yàn)研究中通常利用偏振光技術(shù)來(lái)觀察具有雙折光特性的物質(zhì),其可揭示從而探討這類(lèi)物質(zhì)在生物體生理、病理狀態(tài)下結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生的改變。
膠原纖維是具有雙折光性的物質(zhì),Puchtler等最先發(fā)現(xiàn)以天狼猩紅溶解于飽和脂肪酸溶液中,可以使膠原纖維特異性持續(xù)染色,且不易褪色,在偏振光顯微鏡下染色之后的膠原纖維清晰可辨[2]。然而這種方法對(duì)膠原纖維的檢測(cè)有著很大的局限:傳統(tǒng)偏振光顯微鏡采用兩片正交偏振光片,其呈現(xiàn)原理為線(xiàn)偏振,當(dāng)纖維排列方向與兩塊偏振光片的某一透射軸平行時(shí),經(jīng)天狼猩紅染色后的纖維在視野中就無(wú)法被觀察到。雖然通過(guò)改變組織切片的方向可以減小這種弊端,但是纖維的形態(tài)通常是有褶皺的,甚至為波浪狀的,即使旋轉(zhuǎn)載物臺(tái),某些部分的纖維依然不可見(jiàn),從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。采用圓偏振光照明可彌補(bǔ)線(xiàn)偏振光照明的不足,無(wú)論雙折射的物質(zhì)取向如何,在視野中均清晰可見(jiàn)[3]。
Abrio液晶偏光影像系統(tǒng)由美國(guó)CRi公司研發(fā),采用LC-PolScope核心技術(shù),其特有的液晶補(bǔ)償光學(xué)元件可以將偏振光波產(chǎn)生的光程差信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào),再通過(guò)軟件在監(jiān)測(cè)器上還原成明暗不同的光信號(hào)。Abrio在傳統(tǒng)線(xiàn)形偏振光片的基礎(chǔ)上,加裝了四分之一濾波片,構(gòu)成了CP/IF(circular polarizer and interference filter)組件,光波通過(guò)該組件時(shí)產(chǎn)生單色的近似圓偏振光,從而彌補(bǔ)了線(xiàn)偏振光光軸方向的局限。較傳統(tǒng)偏振光顯微鏡最大的不同是:在組織未經(jīng)染色的狀態(tài)下,Abrio不僅可以對(duì)具有雙折射的物質(zhì)進(jìn)行定性觀測(cè),同樣可以對(duì)雙折射的強(qiáng)度和方向進(jìn)行定量分析。除此之外,Abrio特有的液晶補(bǔ)償器替代了傳統(tǒng)光學(xué)補(bǔ)償器,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)雙折光性物質(zhì)高靈敏度的成像。Abrio目前已應(yīng)用于羽毛中的角蛋白[4]、活細(xì)胞分裂過(guò)程中的紡錘體[5]、神經(jīng)細(xì)胞突觸發(fā)育過(guò)程[6]等方面的研究,但在心血管系統(tǒng)的研究中還未見(jiàn)應(yīng)用。
本研究中,我們建立了衰老大鼠動(dòng)物模型,選取青年大鼠和衰老大鼠胸主動(dòng)脈為研究對(duì)象,未經(jīng)染色狀態(tài)下應(yīng)用Abrio液晶偏光影像系統(tǒng)觀察青年與衰老大鼠主動(dòng)脈纖維結(jié)構(gòu)的差異,而后對(duì)主動(dòng)脈進(jìn)行苦味酸天狼猩紅染色,對(duì)比觀察傳統(tǒng)偏振光與Abrio對(duì)主動(dòng)脈纖維結(jié)構(gòu)成像的差異,探討生物組織偏振光學(xué)特征測(cè)量的優(yōu)勢(shì)和特色,為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
健康雄性Wistar大鼠20月齡7只(衰老組),2月齡7只(青年組)。動(dòng)物級(jí)別:二級(jí),購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。常規(guī)飼養(yǎng)一周后進(jìn)行手術(shù)。
苦味酸天狼猩紅染液(雪邦科技有限公司),戊二醛(上?;瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站),中性福爾馬林溶液(北京化工廠(chǎng)),二甲苯(北京化工廠(chǎng)),石蠟(北京化工廠(chǎng)),酒精(北京化工廠(chǎng))。
組織切片機(jī)(Thermo 77500101,英國(guó)),烘片機(jī)(Thermo 3120061,英國(guó)),漂片儀(Thermo 3120059 Round Bath,英國(guó)),倒置顯微鏡(Nikon TE2000,日本),液晶偏光影像系統(tǒng)(CRi Abrio,美國(guó)),偏光顯微鏡:光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX51,日本)。
主動(dòng)脈切片的制備:5 mg/mL戊二醛麻醉,處死動(dòng)物并留取標(biāo)本:開(kāi)胸,輕柔分離胸主動(dòng)脈降段(沿主動(dòng)脈出口水平至膈肌入口處),0.9%NaCl溶液沖洗血管內(nèi)殘存血液,濾紙吸干,取主動(dòng)脈出口端0~3 mm處血管,10%中性福爾馬林溶液固定24 h后,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋,從近心端血管橫斷面開(kāi)始制作石蠟切片,片厚4 μm。
天狼猩紅染色:Abrio拍照后的切片置于-4℃冰箱保存,隔日進(jìn)行苦味酸天狼猩紅染色:切片常規(guī)至水后,0.1%苦味酸天狼猩紅染液染色,90 min后終止染色,清水漂洗數(shù)次并常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。
觀察:主動(dòng)脈切片制備完成后,常規(guī)脫蠟,不染色條件下在普通光學(xué)顯微鏡下、傳統(tǒng)偏振光顯微鏡下、Abrio液晶偏振光顯微鏡下分別觀察主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)并拍照。結(jié)合圖像分析軟件,對(duì)Abrio拍照后的圖像進(jìn)行雙折射方向的定性及定量分析。
天狼猩紅染色后的切片在傳統(tǒng)線(xiàn)偏光顯微鏡下找到未染色時(shí)Abrio拍照的相同部位,對(duì)染色后的切片再次進(jìn)行拍照,對(duì)比Abrio圓偏振和傳統(tǒng)線(xiàn)偏振技術(shù)成像特點(diǎn)的差別,并對(duì)染色后青年、衰老大鼠主動(dòng)脈的Abrio圖像進(jìn)行光程差的定量分析。
采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,對(duì)分組變量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),各指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
如圖1所示,未經(jīng)染色的主動(dòng)脈組織切片在普通光學(xué)顯微鏡下(圖1A,圖1B)、傳統(tǒng)偏振光顯微鏡下(圖1C,圖1D)、Abrio液晶偏振光顯微鏡下(圖1E,圖1F)可見(jiàn):具有雙折光性的纖維在Abrio偏振光顯微鏡下清晰可見(jiàn),在傳統(tǒng)偏振光顯微鏡下呈像靈敏度差,強(qiáng)度低,與背景不易分辨,而在普通顯微鏡下則無(wú)法對(duì)纖維進(jìn)行成像。青年(圖1E)和衰老大鼠(圖1F)主動(dòng)脈的Abrio圖像清晰顯示:衰老大鼠較青年大鼠血管壁增厚,血管外膜結(jié)締組織增多,以纖維組織增多為主,且分布更為致密,外膜明顯增厚,增多的纖維條索狀結(jié)構(gòu)明顯(箭頭所示)。青年大鼠主動(dòng)脈全層均有較強(qiáng)的雙折射,多層彈性膜清晰可見(jiàn);衰老大鼠主動(dòng)脈內(nèi)彈性膜和外彈性膜信號(hào)雙折射較強(qiáng),但兩層彈性膜之間的中膜雙折射信號(hào)較青年組明顯減弱,層狀彈性膜結(jié)構(gòu)也變得模糊不清。
圖1 普通光學(xué)顯微鏡下、傳統(tǒng)偏振光顯微鏡下、Abrio液晶偏光顯微鏡下未經(jīng)染色的大鼠胸主動(dòng)脈×200Fig.1 Unstained thoracic aorta of rats under ordinary optical microscope,traditional polarizing microscope and Abrio imaging system×200
圖2為利用Abrio圖像分析軟件自帶的方向偽彩(圖2A、圖2C)和矢量標(biāo)注(圖2B、圖2D)功能,對(duì)圖1中(圖1E、圖1F)主動(dòng)脈雙折射方向特征進(jìn)行定性分析。該功能可將圖像中雙折射同一方向的結(jié)構(gòu)按同一顏色或同一方向的矢量標(biāo)注出來(lái)。根據(jù)圖像可見(jiàn),青年大鼠主動(dòng)脈纖維呈環(huán)向分布,數(shù)層彈性膜顏色分布較均勻(圖2A),纖維狀結(jié)構(gòu)的矢量方向較整齊(圖2B)。而衰老大鼠主動(dòng)脈的內(nèi)、外彈性膜中的雙折射明顯強(qiáng)于二者之間其他各層彈性膜,顏色深,纖維在內(nèi)、外彈性膜中保持環(huán)狀排列(圖2C),矢量圖中(圖2D)動(dòng)脈中膜靠近內(nèi)膜一側(cè)的分子矢量方向較不規(guī)則。對(duì)于外膜膠原纖維,因其空間上為三維分布,其排列方向隨增齡的變化規(guī)律還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
圖2 未經(jīng)染色的主動(dòng)脈Abrio雙折光信號(hào)方向特征的定性分析 ×200Fig.2 The qualitative analysis of orientation of birefringence signals of undyed thoracic aorta,using Abrio imaging system×200
為了進(jìn)一步探討纖維排列方向在大鼠衰老過(guò)程中的變化,本實(shí)驗(yàn)又對(duì)青年與衰老大鼠Abrio圖像的雙折射信號(hào)進(jìn)行了方位角的定量研究。為了排除圖片中管壁方向的影響,用軟件自帶的直線(xiàn)掃描功能畫(huà)一條與管壁方向垂直、貫穿中膜和內(nèi)膜全層的直線(xiàn)(圖3A),軟件可自動(dòng)對(duì)這條直線(xiàn)上雙折射的方位角(Azimuth)進(jìn)行定量測(cè)量(方位角測(cè)量自動(dòng)將0°-180°計(jì)為有效值,圖3B)。為了衡量該條直線(xiàn)上雙折射方向的變化,我們選擇方位角的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行記錄(圖3C)。同一張照片上我們?cè)匐S機(jī)畫(huà)出4條直線(xiàn),對(duì)這5條直線(xiàn)所記錄的標(biāo)準(zhǔn)差取平均值,得到該張圖片的5條隨機(jī)選取的直線(xiàn)上從血管內(nèi)膜到中膜方位角變異程度的平均值,依照此方法完成其余青年和衰老組大鼠主動(dòng)脈圖像中方位角變異程度的平均值的記錄,并將平均值作為統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)量,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,比較雙折射方向的變異程度在青年大鼠與衰老大鼠主動(dòng)脈中的差別,以此評(píng)價(jià)隨著大鼠的衰老,纖維排列方向發(fā)生的改變。結(jié)果表明(表1):青年組大鼠胸主動(dòng)脈雙折射方位角的變異程度明顯小于衰老組,證明隨著增齡,大鼠胸主動(dòng)脈纖維排列方向發(fā)生一定程度的紊亂。
圖3 未染色主動(dòng)脈偏振光信號(hào)方位角的定量分析Fig.3 The quantitative analysis of azimuth of birefringence signals of undyed thoracic aorta,using Abrio imaging system×200
如圖4所示:經(jīng)苦味酸天狼猩紅特異性染色后的膠原纖維主要集中于主動(dòng)脈外膜,旋轉(zhuǎn)線(xiàn)偏振光裝置的起偏器于合適位置(圖4A,圖4B),根據(jù)纖維的雙折光性強(qiáng)弱,可見(jiàn)信號(hào)表達(dá)呈現(xiàn)出顏色上的差別。較粗大的纖維折光性強(qiáng),呈現(xiàn)紅色或橙黃色;較細(xì)小的纖維折光性弱,呈現(xiàn)綠色。被染成紅色的纖維呈條索狀,數(shù)量多且清晰可見(jiàn);被染成綠色的纖維散布在紅色纖維周?chē)?,表達(dá)較少且不易分辨。線(xiàn)偏光顯微鏡下主動(dòng)脈中膜和內(nèi)膜幾乎不見(jiàn)偏光信號(hào)。采用Abrio液晶偏振光技術(shù)觀察染色后的主動(dòng)脈(圖4C,圖4D),可見(jiàn)外膜纖維雙折射信號(hào)表達(dá)位置較圖4A、圖4B更加完整,血管外膜膠原雙折射信號(hào)強(qiáng),中膜和內(nèi)膜也有雙折射信號(hào),但較外膜弱,衰老組中膜和內(nèi)膜膠原纖維雙折射較青年組明顯增強(qiáng)。
圖4 主動(dòng)脈苦味酸天狼猩紅染色后傳統(tǒng)線(xiàn)偏振光和Abrio液晶偏振光圖像 ×200Fig.4 Thoracic aorta of rats under traditional polarizing microscope and Abrio imaging system after being stained with picric-sirius red×200
用Abiro系統(tǒng)軟件自帶功能對(duì)Abrio圓偏振圖像中青年和衰老大鼠胸主動(dòng)脈膠原纖維的光程差和外膜膠原纖維層厚度進(jìn)行定量,結(jié)果表明(表2):衰老大鼠較青年大鼠主動(dòng)脈纖維的雙折射光程差增大,外膜膠原纖維層厚度明顯增厚。說(shuō)明隨著增齡,衰老大鼠主動(dòng)脈纖維結(jié)構(gòu)的雙折光性增強(qiáng),膠原纖維增多,外膜增厚。
表1 大鼠胸主動(dòng)脈雙折射方位角的變異程度Tab.1 The azimuth variation of birefringence of thoracic aorta
表2 胸主動(dòng)脈膠原纖維平均光程差與外膜纖維層厚度Tab.2 The retardance of collagen fibers and the thickness of fiber layer of thoracic aorta
對(duì)于大動(dòng)脈血管來(lái)說(shuō),纖維結(jié)構(gòu)既是維持血管結(jié)構(gòu)的組成部分,同時(shí),又在承受力量負(fù)荷中發(fā)揮重要作用。健康人動(dòng)脈分為三層:內(nèi)膜、中膜和外膜。內(nèi)膜主要由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成,另外還有一層很薄的結(jié)締組織,即內(nèi)皮下層。內(nèi)皮下層中含有少量的膠原纖維和彈性纖維,有的動(dòng)脈在內(nèi)皮下層和中膜之間還有一層內(nèi)彈性膜。大動(dòng)脈的中膜主要以彈性膜為主,間有少許平滑肌細(xì)胞。平滑肌細(xì)胞可產(chǎn)生膠原纖維、彈性纖維和基質(zhì),因其形狀細(xì)長(zhǎng),呈纖維狀,也稱(chēng)為平滑肌纖維。外膜主要為疏松結(jié)締組織構(gòu)成,其中含有膠原纖維和彈性纖維,在有的動(dòng)脈中膜和外膜的交界處,有密集的彈性纖維組成的外彈性膜。血管中的纖維結(jié)構(gòu)對(duì)血管的結(jié)構(gòu)和功能起到重要的作用,膠原纖維決定血管的張力強(qiáng)度,彈性纖維決定血管的彈力性能[7]。隨著年齡增加,血管壁增厚,膠原纖維增多,管壁僵硬度增加;反之,彈性纖維隨著增齡而減少,其間彈性蛋白斷裂、崩解成碎片,動(dòng)脈彈性因而降低。與此同時(shí),平滑肌細(xì)胞增殖、遷移,纖維收縮功能減弱。正因?yàn)槔w維成分在血管的結(jié)構(gòu)和功能中具有上述極為重要的作用,因此,對(duì)于纖維的觀察與檢測(cè)一直以來(lái)作為評(píng)估血管生理病理狀態(tài)的一項(xiàng)重要標(biāo)準(zhǔn)。
血管壁中的膠原纖維、彈性纖維和平滑肌纖維都具有雙折光性[8,9,13],因此,Abrio 液晶偏光圖像中這三種纖維均有雙折射信號(hào)表達(dá)。膠原纖維主要分布于血管外膜,可由外膜成纖維細(xì)胞大量分泌[10,11];彈性纖維在血管中膜、內(nèi)外彈性膜中大量分布,主要由血管平滑肌細(xì)胞分泌[12]。對(duì)比觀察青年大鼠和老年大鼠主動(dòng)脈纖維結(jié)構(gòu),可見(jiàn)隨著增齡,大鼠胸主動(dòng)脈管壁增厚,外膜膠原纖維增多。更有特點(diǎn)的是圖像中可見(jiàn)增齡大鼠較青年大鼠內(nèi)、外彈力膜增厚,雙折射增強(qiáng),這可能是增齡導(dǎo)致的血管老化、管壁承受的壓力增高所引起的代償性反應(yīng)。相反,增齡大鼠中膜信號(hào)減弱,層狀彈力膜結(jié)構(gòu)不清,分析這種現(xiàn)象,增齡引起的彈性纖維減少,彈性蛋白斷裂、崩解可能是其最直接的原因。運(yùn)用Abrio自帶的雙折射方向的定性與定量分析功能可以得出,隨著大鼠的增齡,纖維的雙折射方向發(fā)生紊亂,這可能是由增齡導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,血管壁結(jié)構(gòu)損傷,平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜方向移動(dòng),彈性蛋白斷裂所引起的 。Abrio液晶偏光影像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在未經(jīng)染色的情況下,對(duì)生物組織雙折射的值和方向進(jìn)行定量觀察和測(cè)量,而普通光學(xué)顯微鏡和傳統(tǒng)偏光顯微鏡在未經(jīng)染色的情況下對(duì)血管的成像不清晰,且無(wú)法定量反映纖維的結(jié)構(gòu)與分布情況。用苦味酸天狼猩紅對(duì)膠原纖維進(jìn)行特異性染色,其原理是膠原含有大量的堿性氨基酸基團(tuán),與苦味酸天狼猩紅陰離子結(jié)合后,染料分子以在長(zhǎng)軸方向彼此平行排列的方式附著于每個(gè)膠原分子,從而使膠原的雙折光性明顯增強(qiáng)[13,14]。所以在 Abrio顯微鏡下,染色后的圖像(圖4.C、圖4.D)與未染色的圖像(圖 1.E、圖 1.F)相比,血管外膜膠原纖維雙折射大大增強(qiáng),中膜其他物質(zhì)的雙折射則相對(duì)變?nèi)?,從而?shí)現(xiàn)了對(duì)膠原纖維的獨(dú)立成像。傳統(tǒng)線(xiàn)偏振光結(jié)合苦味酸天狼猩紅染色觀察膠原纖維也是利用了這個(gè)原理。然而,對(duì)比Abrio的偏振光圖像和線(xiàn)偏振光成像結(jié)果不難發(fā)現(xiàn),Abrio產(chǎn)生的近似圓偏振光圖像明顯比線(xiàn)偏振光對(duì)于膠原的分布和形態(tài)反映的更加清晰、完整,這是由于膠原纖維形態(tài)卷曲,甚至呈波浪狀,一部分纖維的排列方向與兩塊偏振光透射軸均平行,線(xiàn)偏振光顯微鏡下無(wú)法觀測(cè)到這些纖維。反之,圓偏振光則不受纖維排列方向的局限,使所有被特異性染色的膠原纖維得以成像。不僅如此,以往的研究多采用線(xiàn)偏振光結(jié)合天狼猩紅染色技術(shù)來(lái)區(qū)分組織中的I型與III型膠原,該種方法認(rèn)為染色后的膠原在線(xiàn)偏振光作用下,呈現(xiàn)紅色和黃色信號(hào)的纖維偏光作用強(qiáng),為I型膠原;呈現(xiàn)綠色信號(hào)的纖維偏光作用弱,為III型膠原[15,16]。然而在實(shí)際操作過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn),這種區(qū)分方法有很大的局限:即旋轉(zhuǎn)起偏器,使起偏器透射軸方向發(fā)生改變,可見(jiàn)圖像中纖維數(shù)量、強(qiáng)度和紅綠纖維比發(fā)生很大改變。近些年越來(lái)越多的研究者也開(kāi)始質(zhì)疑:雖然III型膠原多數(shù)較I型膠原細(xì)小,但是,除了III型膠原外,不成熟的或者是較細(xì)小的I型膠原也可產(chǎn)生綠色信號(hào),所以測(cè)量目前不足以用來(lái)區(qū)分I型與III型膠原[3]。Abrio圖像中我們還發(fā)現(xiàn),血管中膜也有雙折射,只是較外膜弱,而線(xiàn)偏振光下不見(jiàn)中膜顯示偏振信號(hào)表達(dá)。分析這種現(xiàn)象,實(shí)際上血管中膜的平滑肌細(xì)胞也可分泌少量的膠原纖維,所以不僅在血管外膜,中膜也應(yīng)有一定的雙折射,且隨著大鼠的增齡,中膜中的膠原纖維分泌增多,管壁硬化。因此,Abrio的成像較傳統(tǒng)偏振光成像更符合血管的生理結(jié)構(gòu),得到的圖像具有更高的可信性。Abrio液晶圓偏光影像技術(shù)還可實(shí)現(xiàn)對(duì)雙折射信號(hào)光程差的定量分析,本實(shí)驗(yàn)中衰老組大鼠胸主動(dòng)脈膠原纖維雙折射的光程差較青年組明顯增大,這說(shuō)明隨著大鼠的增齡,主動(dòng)脈中膠原纖維增多,外膜增厚。由此可見(jiàn),Abrio液晶偏光影像系統(tǒng)在組織雙折光性強(qiáng)弱的判斷上,同樣優(yōu)于其它偏光影像技術(shù),在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究中,我們將用該方法進(jìn)行I、III型膠原判定,以拓展其應(yīng)用面。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)將Abrio液晶偏光影像技術(shù)應(yīng)用于大鼠胸主動(dòng)脈纖維結(jié)構(gòu)的觀察,認(rèn)為該技術(shù)對(duì)具有雙折光性物質(zhì)的研究具有以下優(yōu)勢(shì):圓偏振光片使顯像較線(xiàn)偏振光片更加精確,完整;獨(dú)有的液晶光學(xué)補(bǔ)償器可實(shí)現(xiàn)高靈敏度成像;非侵入性,不用熒光染料或染色劑,避免對(duì)組織造成傷害;結(jié)合圖像分析軟件可以進(jìn)行雙折光強(qiáng)弱和方向的定性與定量分析;方便易用等。因此,定量偏振光影像技術(shù)在未來(lái)生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究中定會(huì)體現(xiàn)更大的價(jià)值。
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