李 晨 呂晨曦 吳 磊

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000； 2. 泰山學(xué)院，山東 泰安 271000)

當(dāng)今競技體育競爭日趨激烈，重復(fù)運動已成為重要訓(xùn)練手段，而在運動訓(xùn)練產(chǎn)生的損傷中，骨骼肌微損傷所占比率最高，表現(xiàn)為肌肉延遲性酸痛[1]。研究表明，訓(xùn)練期給與適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)干預(yù)有助于運動性骨骼肌微損傷的修復(fù)。泰山赤靈芝能夠提高人體免疫力，促進人體新陳代謝，對疲勞過度、久病體虛等癥有輔助治療作用。本項目通過成年雄性SD大鼠跑臺實驗構(gòu)建動物模型，利用泰山赤靈芝進行營養(yǎng)干預(yù)。力求發(fā)現(xiàn)泰山赤靈芝在骨骼肌微損傷恢復(fù)過程中所起到的保護作用。

1 材料與方法

1.1一般資料 動物模型構(gòu)建及分組：成年雄性SD大鼠52只，隨機分為2組：對照組、實驗組。重復(fù)運動的動物模型構(gòu)建：大鼠在跑臺上進行下坡跑，速度18m/min，坡度-16度，進行大運動量重復(fù)訓(xùn)練(力竭運動)。設(shè)立實驗組(喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液)、對照組，進行同樣的重復(fù)力竭運動，在同一時間點分別對正常對照組、實驗組在大運動量重復(fù)訓(xùn)練(力竭運動)后取股四頭肌，同時對實驗組大鼠進行治療量泰山赤靈芝喂養(yǎng)，考察該藥對大運動量重復(fù)訓(xùn)練(力竭運動)下大鼠骨骼肌微損傷變異是否有影響。觀察對照組、實驗組大運動量重復(fù)訓(xùn)練(力竭運動)下大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變異進行研究。所有大鼠實驗前均未進行過跑臺運動。動物飼養(yǎng)室符合國家二級動物飼養(yǎng)標準，自由飲食。

1.2實驗方案

1.2.1設(shè)立實驗組(喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液)、對照組，進行同樣進行大運動量重復(fù)訓(xùn)練(力竭運動)，在同一時間點分別對正常對照組、實驗組在大運動量重復(fù)訓(xùn)練(力竭運動)后用頸椎脫臼法處死，在股四頭肌上取大、小兩塊肌肉，小塊肌肉迅速切成米粒大小的組織塊，取材后放入濃度為3.5%的戊二醛固定液中固定過夜(備電鏡觀察)。大塊肌肉放入濃度為10%的中性緩沖福爾馬林固定液中固定過夜(備光鏡觀察)。

1.2.2電鏡標本及切片制作 電鏡標本用0.1M PH值為7.2的磷酸緩沖液沖洗5次，每隔20分鐘沖洗一次。用1%的鋨酸(四氧化鋨)再固定4小時后，再用0.1M、PH值為7.2的磷酸緩沖液沖洗5次，每20分鐘一次。用梯度乙醇脫水(30%、55%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇)每步時間為30分鐘，再用環(huán)氧丙烷過渡兩次，每次2小時。使用Epon812樹脂浸透，包埋，聚合。使用LKB超薄切片機進行超波切片，用醋酸鈾——檸檬酸鉛雙染色。制成的電鏡切片使用美國GE公司生產(chǎn)的透射電鏡(山東農(nóng)業(yè)大學(xué))進行觀察，并拍照。

1.3指標觀察 電鏡下觀察。

1.3.1骨骼肌的粗、細兩種肌絲、位于肌節(jié)的A帶、M線、Z線、H帶、I帶、A帶；

1.3.2橫小管：是肌膜向肌漿內(nèi)凹陷形成的小管網(wǎng)，橫小管可將肌膜的興奮迅速傳到每個肌節(jié)。

1.3.3線粒體(mitochondrion)：粒體為線狀、長桿狀、卵圓形或圓形小體，外被雙層界膜。

1.3.4細胞核：主要看核膜厚度、基質(zhì)電子密度高低、有無核邊集現(xiàn)象。

2 結(jié) 果

電鏡結(jié)果：正常對照組(圖1)顯示未受到任何損傷的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)。①重復(fù)運動即刻AO組(圖2)顯示正常肌節(jié)、線粒體；②重復(fù)運動后24 h(圖3)：線粒體出現(xiàn)水腫，內(nèi)部的嵴開始融解，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，其外膜不完整。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌纖維均出現(xiàn)不同的變化。③重復(fù)運動后48h(圖4)：肌細胞機能開始恢復(fù)，線粒體雖然仍有受到損傷的跡象，但已可以看出正在開始逐漸恢復(fù)。④重復(fù)運動后72h(圖5)：帶出現(xiàn)過度收縮現(xiàn)象，相比48h后細胞結(jié)構(gòu)有恢復(fù)跡象，但線粒體數(shù)量較少，同時外膜仍然尚未恢復(fù)完整。⑤重復(fù)運動后168h(圖6)：細胞結(jié)構(gòu)、線粒體數(shù)量初步恢復(fù)，但不明顯。

喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液重復(fù)運動實驗組①重復(fù)運動實驗組即刻B0組(圖7)：僅出現(xiàn)線粒體數(shù)量較少的現(xiàn)象，同時有少部分肌節(jié)被拉長，產(chǎn)生變化；② 重復(fù)運動后24h(圖8)：線粒體外膜較為正常，個別存在差異，細胞結(jié)構(gòu)開始恢復(fù)；③重復(fù)運動后48h(圖9)：肌節(jié)I帶變長，線粒體的空泡化現(xiàn)象出現(xiàn)，相比較A組，本組的現(xiàn)象細胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)明顯，部分肌節(jié)被拉長；④重復(fù)運動后72h(圖10)：骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的修復(fù)有顯著改善，恢復(fù)明顯，線粒體數(shù)量較少，外膜不完整；⑤；重復(fù)運動后168h(圖11、12)：骨骼肌超微結(jié)構(gòu)得到充分修復(fù)及得到保護，但是仍表現(xiàn)為肌原纖維排列不規(guī)則，肌節(jié)不完整，Z線變細，肌絲卷曲等表現(xiàn)。

研究結(jié)果顯示重復(fù)性力竭離心運動引起骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的損傷。損傷變化主要表現(xiàn)為：運動后即刻骨骼肌細胞膜發(fā)生局部模糊、溶解，肌纖維間嵴有缺損，核膜皺縮，肌細胞內(nèi)線粒體空泡變性改變。隨著時間的延長，至運動后24h、48h損傷程度最重，出現(xiàn)肌纖維排列紊亂、扭曲，肌細胞膜溶解，Z線紊亂呈鋸齒狀，且部分消失，線粒體空泡變性改變加重。運動后72h骨骼肌細胞超微結(jié)構(gòu)、功能逐漸恢復(fù)，機體損傷程度開始逐漸降低，運動后168h，肌纖維排列基本正常，細胞膜部分皺縮，核膜間隙局部擴張，未見肌纖維水腫，Z線明暗帶、M線均可分清。喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液重復(fù)運動實驗組骨骼肌超微結(jié)構(gòu)修復(fù)明顯，隨著時間推移有顯著改善，因此，泰山赤靈芝對重復(fù)運動后骨骼肌微損傷的保護作用。

圖1 正常對照組

圖2 重復(fù)運動即刻AO組

圖3 重復(fù)運動后24h

圖4 重復(fù)運動后48h

圖5 重復(fù)運動后72h

圖6 重復(fù)運動后168h

圖7 重復(fù)運動實驗組即刻B0組

圖8 重復(fù)運動后24h

圖9 重復(fù)運動后48h

圖10 重復(fù)運動后72h

圖11 重復(fù)運動后168h

圖12 重復(fù)運動后168h

3 討 論

本研究設(shè)立正常對照組與實驗組，通過正常對照組與喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液重復(fù)運動實驗組透射電鏡觀察重復(fù)離心運動后大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化，觀察大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)在喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液后具有對骨骼肌微損傷防護作用。從而推測重復(fù)離心運動后骨骼肌超微結(jié)構(gòu)圖譜變異與骨骼肌微損傷可能存在的適應(yīng)性恢復(fù)機制。為下一步尋找能夠延緩運動性疲勞、減輕骨骼肌損傷、提高競技能力且安全有效、無毒副作用的非興奮劑—泰山赤靈芝帶來的骨骼肌修復(fù)機制進行探討，可望對骨骼肌微損傷預(yù)防恢復(fù)機制帶來新的證據(jù)，使得重復(fù)離心運動造成的骨骼肌微損傷的防護研究打下良好的基礎(chǔ)。

我們在實際的運動訓(xùn)練過程中，機體進行大運動量、強度突然增加或運動方法突然改變時，通常會誘發(fā)肌肉延遲性酸痛(DOMS)的現(xiàn)象。1902年，Hough首先進行了，并提出了DOMS損傷學(xué)說，并認為酸痛是由于肌肉內(nèi)部的損傷造成的[3]。事實上，延遲性肌肉酸痛及其伴隨改變常發(fā)生在許多運動項目中，如短跑、長跑和抗阻訓(xùn)練等運動中均可發(fā)生。許多運動都包含有大量離心收縮成分的肌肉運動，這是運動訓(xùn)練中不可避免的現(xiàn)象。近來，有學(xué)者提出，環(huán)境或運動疲勞與骨骼肌超微結(jié)構(gòu)、功能的變化直接相關(guān)。這些變化主要包括敏感細胞器線粒體的積極響應(yīng)，能源物質(zhì)的積累，骨骼肌纖維結(jié)構(gòu)的改變和自由基、ATP等對細胞凋亡的啟動[4][5]。

本實驗中我們發(fā)現(xiàn)離心運動后骨骼肌出現(xiàn)明顯的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的變化，并且，這種變化具有顯著的適應(yīng)性，表現(xiàn)出明顯的延遲性，重復(fù)運動過程中骨骼肌超微結(jié)構(gòu)有顯著恢復(fù)的趨勢，如開始階段以間質(zhì)血管改變和炎癥細胞浸潤為特征，隨后則可見肌細胞腫脹，超微結(jié)構(gòu)的變化在運動后48 h最為明顯，而HE切片所觀察到的組織學(xué)變化則在運動后48 h最為明顯。電鏡下骨骼肌細損傷的組織形態(tài)變化表現(xiàn)主要有：肌原纖維排列混亂、肌節(jié)、肌絲排列紊亂、Z線模糊、扭曲，呈鋸齒狀、波紋狀變化。肌核腫脹或固縮，線粒體腫脹等。這種變化是骨骼肌對運動負荷刺激的反應(yīng)，提示這種運動性骨骼肌微損傷未必是一種完全的病理過程，可能是骨骼肌適應(yīng)運動訓(xùn)練刺激的一個介于生理與病理的中間過程——“先解離而后才重新建構(gòu)”，可能正是骨骼肌對運動訓(xùn)練刺激的一種適應(yīng)[7，8]。

目前，公認的理論是運動性骨骼肌微損傷是由于長時間、高強度、重復(fù)運動后的結(jié)果，常表現(xiàn)為延遲性肌肉酸痛，盡管有自主緩解跡象，但由于延遲性肌肉酸痛的癥狀體征對運動訓(xùn)練的影響，以及肌肉酸痛與肌肉拉傷存在某種內(nèi)在的聯(lián)系等原因。所以，幾十年來國內(nèi)外學(xué)者一直嘗試了解運動性骨骼肌微損傷的特性，力求尋找一些解決辦法。為探尋最新的、可靠的、有效的方法來防預(yù)運動性骨骼肌微損傷提供理論參考依據(jù)。當(dāng)前，解釋骨骼肌微損傷現(xiàn)象的假說主要是機械損傷和化學(xué)損傷兩種假說[9]。運動性疲勞的產(chǎn)生是機體進行體育鍛煉和運動訓(xùn)練中不可避免的現(xiàn)象，也是扼制鍛煉和訓(xùn)練效果的重要因素之一。適度的重復(fù)運動恢復(fù)性訓(xùn)練(骨骼肌產(chǎn)生疲勞后施以合理的恢復(fù)手段)可以促進人體超微結(jié)構(gòu)機能修復(fù)水平的再提高，而過度的運動性疲勞且不及時消除，使疲勞產(chǎn)生堆積，無助于人體骨骼肌超微結(jié)構(gòu)機能水平的提高，直接影響運動訓(xùn)練的質(zhì)量和比賽水平的正常發(fā)揮，對健康形成損害。從研究來看，尋找能夠延緩運動性疲勞、減輕骨骼肌損傷、提高競技能力且安全有效、無毒副作用的非興奮劑物質(zhì)，成為國內(nèi)外運動醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注的焦點與難點。特別在訓(xùn)練期給與這種物質(zhì)補充及干預(yù)，有助于運動性骨骼肌微損傷超微結(jié)構(gòu)的盡快修復(fù)，是今后研究的方向。

離心運動所致的骨骼肌微損傷具有一定的延遲現(xiàn)象，在1次離心運動后即刻，骨骼肌微損傷在光鏡及電鏡下觀察變化輕微，但在運動后24h～48h超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著的損傷性變化，而運動后48h骨骼肌微損傷超微結(jié)構(gòu)可以逐漸適應(yīng)性恢復(fù)，72h骨骼肌微損傷超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)顯著的適應(yīng)性恢復(fù)。

喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液重復(fù)運動實驗組透射電鏡觀察大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)在喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液后具有對骨骼肌微損傷修復(fù)防護作用。電鏡下直接觀察到運動后骨骼肌微損傷超微結(jié)構(gòu)的變化。重復(fù)離心運動可以對骨骼肌肌纖維損傷產(chǎn)生一定的累加作用。

超微結(jié)構(gòu)顯示，運動后出現(xiàn)骨骼肌結(jié)構(gòu)的損傷性變化，但是，B組較A組在同一時間點損傷減輕，提示：運動性骨骼肌微損傷未必是一種完全的病理過程，可能是骨骼肌適應(yīng)運動訓(xùn)練刺激的一個介于生理與病理的中間過程。其機理可能是喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液后經(jīng)過力竭性運動訓(xùn)練損傷修復(fù)后的肌肉增強了抗損傷能力的結(jié)果。

重復(fù)離心運動確實存在骨骼肌微損傷現(xiàn)象，并且骨骼肌超微結(jié)構(gòu)存在運動性適應(yīng)以及運動性損傷的疊加效應(yīng)[10,11]。

值得進一步研究的題目：

(1)離心運動導(dǎo)致的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化不一定是一種完全的病理過程，是否是肌節(jié)的主動適應(yīng)過程，有待進一步研究。

(2)骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化與基質(zhì)、肌膜結(jié)構(gòu)的關(guān)系，有待進一步論證。

肌節(jié)恢復(fù)、重塑過程是否需要炎癥因子參與(有學(xué)者報道：運動后血液中與炎癥反應(yīng)有關(guān)的蛋白、如急相蛋白和炎癥過程指示物含量增加)，需進一步探究。

總之，運動與骨骼肌關(guān)系的研究雖然是一個老課題，但是，骨骼肌超微結(jié)構(gòu)如何再塑需要深入研究。特別是能夠延緩運動性疲勞、減輕骨骼肌微損傷、提高競技能力且安全有效、無毒副作用的非興奮劑物質(zhì)，對如何有效的運動性肌肉疲勞恢復(fù)、延遲性肌肉酸痛的消除方法的研究，顯得尤為重要。隨著方法學(xué)上的不斷拓展，骨骼肌超微結(jié)構(gòu)、運動性骨骼肌微損傷仍有很大的、很深的研究價值，其研究前景十分廣闊。

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