張婷 徐飛

老年性聾的發(fā)病本質(zhì)在于聽覺器官的老化。衰老的分子生物學(xué)研究證實(shí)器官老化與線粒體基因突變、細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)；活性氧族(ROS)產(chǎn)生的氧自由基損傷以及由此積累的線粒體片段缺失導(dǎo)致的線粒體功能障礙被認(rèn)為是器官衰老的關(guān)鍵因素[1,2]。近年來，具有抗氧化作用的補(bǔ)腎中藥和維生素E等氧自由基拮抗劑成為抗衰老研究的主要藥物，但其在內(nèi)耳老化方面的研究尚不充分。本研究旨在觀察應(yīng)用腎氣丸和維生素E對D-半乳糖致衰老大鼠內(nèi)耳組織線粒體DNA 4834 bp缺失突變的影響，為探索老年聾的有效防治措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 3月齡SPF級SD大鼠40只[上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物合格證號：SCXK(滬)2008-0016]，體重200～300 g，雌雄各半，經(jīng)聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測聽力正常后分為四組：D-半乳糖組、腎氣丸組、維生素E組和對照組，每組10只。

1.2主要藥物與試劑 腎氣丸：按《金匱要略》記載的組成與劑量制成混懸液，含量為生藥1.0 g/ml；D-半乳糖(上海伯奧生物科技有限公司，25g BR，批號091218)；水合氯醛(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠，250g，批號20100915)；維生素E膠丸：0.1克×30粒/盒，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠生產(chǎn)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動物造模與給藥方法 D-半乳糖組給予5%D-半乳糖500 mg·kg-1·d-1頸部皮下注射，連續(xù)8周；腎氣丸組給予等量5%D-半乳糖頸部皮下注射6周后再同時給予腎氣丸混懸液(5 g·kg-1·d-1)灌胃2周；維生素E組大鼠給予等量5% D-半乳糖頸部皮下注射6周后，同時按250 mg·kg-1·d-1的劑量給予維生素E喂服2周；對照組不注射D-半乳糖，在實(shí)驗(yàn)最后2周給予等量生理鹽水灌胃。

1.3.2ABR測試 各組分別于給藥開始前1 d和給藥結(jié)束處死前行ABR測試。大鼠用5%水合氯醛按照6 ml/kg麻醉，用GSI Audera腦干誘發(fā)電位儀進(jìn)行ABR測試，以波Ⅲ為基準(zhǔn)確定反應(yīng)閾。

1.3.3內(nèi)耳組織mtDNA突變檢測 各組動物給藥結(jié)束 ，完成ABR測試后分別處死，提取內(nèi)耳組織，方法：動物斷頭處死，迅速取出一側(cè)聽泡置入4 ℃預(yù)冷的充氧無鈣鎂細(xì)胞外液中(0.1 mol/L,PBS,pH 7.4)，顯微鏡下解剖出耳蝸。取內(nèi)耳組織(約40 mg)置于研缽中，加液氮研磨，再加約2～3 ml勻漿液(0.25 M蔗糖，30 mM Tris-HCl，10 mM Na2EDTA，2.5 mM CaCl2，pH 7.3-8.1)研磨，1 000 r/min 離心10 min，取上清12 000 r/min離心15 min，沉淀即為線粒體。

采用改良的酚-氯仿-異戊醇法提取mtDNA，采用DNA分析儀測定DNA純度(A260nm/A280 nm> 1. 7)，并計(jì)算DNA的質(zhì)量濃度(A260nm×50×DNA稀釋倍數(shù)×10-3)。

PCR擴(kuò)增檢測mtDNA4834片段缺失：引物設(shè)計(jì)參照Gadaleta等(1989)報(bào)道的大鼠mtDNA基因組全序列，由上海生工公司合成。P1：5’-GCGAAGCTTAGAGCGTTAAC-3’ P2：5’-AGTGAGATAAGGAAGCCTGC-3’ P3：5’-AGGACTTAACCAGACCCAAACACG-3’P4：5’-CCTCTTTTCTGATAGGCGGG-3’。

按常規(guī)方法配制25 μl PCR體系，終濃度為模板DNA(mtDNA)(150 ng)，Taq酶(TaKaRa)0.5 U，引物各50 pmol/L，MgCl21.5 mmol/L，dNTP(TaKaRa)200 μmol/L。擴(kuò)增條件(Bio-Rad PCR擴(kuò)增儀)：首次95 ℃變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；末次72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間ABR反應(yīng)閾比較采用單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)和Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間兩兩比較，PCR結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1ABR測試結(jié)果 各組動物實(shí)驗(yàn)前后ABR反應(yīng)閾見表1，可見，實(shí)驗(yàn)前各組大鼠ABR反應(yīng)閾差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)后維生素E組、D-半乳糖組和腎氣丸組ABR反應(yīng)閾均高于對照組(P<0.05)，但這三組之間ABR閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 雙側(cè)檢驗(yàn),P>0. 05) 。

表1 各組實(shí)驗(yàn)前后ABR反應(yīng)閾

注：*與對照組比較，P<0.05

2.2各組大鼠內(nèi)耳組織mtDNA4834 bp缺失突變檢測結(jié)果 按特異性設(shè)計(jì)的引物P3和P4可得約770 bp的mtDNA保守片段，圖1可見8條泳道均擴(kuò)增出目的片段，說明mtDNA提取成功。

mtDNA 4834 bp缺失突變判定: 若存在mtDNA 4834 bp缺失，則引物P1和P2擴(kuò)增4834 bp丟失后斷裂融合基因片段長度為597 bp。如圖2所示，泳道2、3、5、6、7、10、11、13在500 bp和750 bp之間有1條清晰的DNA條帶，片段回收后送杭州寶成生物技術(shù)公司測序，并與Gadateta等(1989)報(bào)道的序列比較，證實(shí)存在約4 000～5 000 bp的mtDNA片段缺失。泳道4、8、9、12無此片段，是因?yàn)檠由鞎r間較短，不足以擴(kuò)增合成近5 000 bp的片段，說明4、8、9、12不存在線粒體片段缺失。

圖1 大鼠內(nèi)耳組織mtDNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

所有標(biāo)本均可擴(kuò)增出770 bp mtDNA 保守片段。維生素E組大鼠20耳中檢出內(nèi)耳組織線粒體DNA4834 bp缺失突變10耳，腎氣丸組大鼠20耳中檢出內(nèi)耳組織線粒體DNA4834 bp缺失突變12耳，D-半乳糖組大鼠18耳(2耳標(biāo)本取材失敗)中檢出內(nèi)耳組織線粒體DNA4834 bp缺失突變16耳，對照組未檢出線粒體DNA4834 bp 缺失突變；維生素E組、腎氣丸組、D-半乳糖組和對照組mtDNA4834 bp缺失突變率分別為50.0%、60.0%、88.89%和0.0%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，腎氣丸組和D-半乳糖組(雙側(cè)檢驗(yàn),P=0.043)、維生素E組和D-半乳糖組(雙側(cè)檢驗(yàn),P=0.010)之間的mtDNA4834 bp缺失率差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腎氣丸組和維生素E組的mtDNA4834 bp缺失率低于D-半乳糖組，但腎氣丸組和維生素E組之間的缺失率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.525)。

圖2 大鼠內(nèi)耳組織mtDNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

近年來，許多學(xué)者[1]認(rèn)為內(nèi)耳組織中mtDNA缺失水平升高是老年性聾最重要的發(fā)病機(jī)制。Seidman等[3]于1996年首次提出并證實(shí)老年大鼠mtDNA4834 bp缺失與衰老及老年性聾有一定相關(guān)性，他們提取了大鼠的大腦、聽神經(jīng)、耳蝸內(nèi)血管紋等組織，通過PCR檢測技術(shù)證實(shí)mtDNA4834的缺失陽性率與老年性聾有一定相關(guān)性。Markaryan等[4]發(fā)現(xiàn)老年性聾患者的顳骨標(biāo)本中mtDNA 4977 bp缺失突變率平均為32%，而相同年齡正常人其缺失突變率為12%。研究表明[4]，D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠模型的聽功能與自然老化動物相似，并伴有內(nèi)耳組織中mtDNA4834 bp大片段缺失存在。本研究結(jié)果顯示，D-半乳糖組大鼠ABR反應(yīng)閾明顯升高，其內(nèi)耳組織線粒體4834 bp缺失突變率為88.89%，說明老化大鼠耳蝸組織中的mtDNA4834缺失突變與其聽覺敏感性下降有關(guān)。

老化的線粒體理論(即氧自由基理論)認(rèn)為，衰老或年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生是由于氧自由基的增加，導(dǎo)致線粒體DNA累積性缺失和突變增加，從而引起線粒體功能障礙，能量產(chǎn)生少，最終影響細(xì)胞正常的生理功能。因此，國內(nèi)外學(xué)者嘗試應(yīng)用抗氧化劑治療老年大鼠[6，7]，發(fā)現(xiàn)長期使用抗氧化劑可以減緩老年性聾的進(jìn)展，也可以在細(xì)胞水平上減少mtDNA的丟失和損傷，降低聽力損失的程度。維生素E不但是活性氧的清除劑，也是脂質(zhì)過氧化的阻斷劑，維生素E能及時清除內(nèi)耳老化過程中產(chǎn)生的氧自由基從而預(yù)防m(xù)tDNA片段缺失的累積?？拙S佳等[7]的研究表明維生素E可以顯著降低阿霉素誘發(fā)大鼠內(nèi)耳組織線粒體DNA 4834 bp 缺失突變的發(fā)生率，說明其對線粒體DNA 有明確的保護(hù)作用。曲嫻等[9]對D-半乳糖誘導(dǎo)所致的衰老小鼠灌服維生素E，發(fā)現(xiàn)維生素E能明顯改善衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，抑制腦組織一氧化氮合酶活性，降低一氧化氮含量，提高谷胱甘肽過氧化酶和琥珀酸脫氫酶活性，防止海馬組織mtDNA缺失突變的發(fā)生等。從本研究結(jié)果看，維生素E組和腎氣丸組ABR反應(yīng)閾雖與D-半乳糖組無顯著差異，但前兩組內(nèi)耳組織mtDNA 4838 bp缺失突變率卻顯著低于D-半乳糖組。說明維生素E雖是一種活性氧的清除劑，具有抗氧化特性，但并不能恢復(fù)氧自由基造成的內(nèi)耳組織損傷。

中醫(yī)理論認(rèn)為衰老和耳聾都是腎虛的臨床表現(xiàn)，腎虛和衰老之間存在著密切聯(lián)系[10]，《素問·陰陽應(yīng)象大論篇》中說：“年五十，體重，耳目不聰明矣。”腎虛與耳聾的關(guān)系則更為明確，《內(nèi)經(jīng)》曰：“腎氣通于耳，腎和則耳能聞五音矣。”前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，老齡豚鼠早期表現(xiàn)為耳蝸老化，并且和腎虛程度有一定的關(guān)系，加重實(shí)驗(yàn)動物的腎虛程度會加快其耳聾的發(fā)展。王學(xué)美等[12]的研究也證實(shí)了腎虛、衰老與外周血線粒體DNA氧化損傷之間的關(guān)系。本研究采用的補(bǔ)腎中藥腎氣丸是《金匱要略》經(jīng)典方。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，該方與維生素E的作用類似，對大鼠內(nèi)耳mtDNA 缺失突變有明顯影響，但未能阻止老化大鼠的聽功能變化。這可能與金匱腎氣丸具有類似抗氧化劑的作用有關(guān)，如邵煥慶等[13]研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣丸能明顯提高老齡大鼠體內(nèi)SOD活性水平，降低MDA水平。王楓等[14]發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸可以降低耳聾豚鼠血清MDA表達(dá)，并能提高SOD活力，有效清除氧自由基，從而對抗慶大霉素的耳毒性。這也提示單獨(dú)使用抗氧化劑不能解決耳蝸老化問題，下一步應(yīng)當(dāng)關(guān)注線粒體內(nèi)氧化與抗氧化平衡的關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)一步探索老年性聾可能的干預(yù)方法。

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