陳浩 謝民強(qiáng) 吳劍 李威 李永賀

耳毒性藥物損傷是導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾的常見(jiàn)因素。氨基糖苷類(lèi)(aminoglycoside antibiotic，AmAn)藥物慶大霉素屬于耳毒性藥物，臨床應(yīng)用廣泛，因其大劑量易致聾[1]，也常用于制造耳蝸損傷動(dòng)物模型。研究認(rèn)為，AmAn產(chǎn)生過(guò)量氧自由基(oxygen-derived free radicals ，OFR)損傷耳蝸[2]是其可能的機(jī)制之一。鹽酸椒苯酮胺(peperphentonamine hydrochloride, PPTA)是我國(guó)自主研發(fā)擬應(yīng)用于心血管保護(hù)的新型鈣增敏劑，臨床研究提示，其具有清除心肌再灌注損傷時(shí)產(chǎn)生的OFR，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的作用[3]。目前尚缺乏PPTA應(yīng)用于耳蝸的研究，為排除其影響耳蝸供血和經(jīng)全身代謝后對(duì)耳蝸組織生化指標(biāo)檢測(cè)的干擾，本研究擬通過(guò)鼓階開(kāi)窗微孔技術(shù)將PPTA注入耳蝸內(nèi)，觀察其對(duì)慶大霉素致豚鼠耳蝸損傷后的聽(tīng)功能、耳蝸組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)、毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變的影響，探討PPTA對(duì)耳蝸損傷的保護(hù)作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年健康白色紅目豚鼠45只，體重250～300 g，雌雄不拘，耳廓反射靈敏，鼓膜完整并均經(jīng)ABR篩查排除了聽(tīng)力異常，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物證編號(hào)：44002100000038)。將豚鼠編號(hào)后按隨機(jī)化原則分為空白對(duì)照組、GM組和PPTA組每組各15只。

1.2主要試劑及儀器 GSH試劑盒A006-1(100T/96樣), SOD試劑盒 A001-1(羥胺法)(南京建成生物工程研究所)；BCA法蛋白定量試劑盒(北京北泰克生物技術(shù)有限公司)；硫酸慶大霉素注射液(廣州白云山天心制藥有限公司，批號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字H44022095)；人工外淋巴液(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心配置)；PPTA溶液，將PPTA粉劑溶于3.5

LEICA M651手術(shù)顯微鏡(徠卡設(shè)備有限公司制造)；ZEISS耳科解剖顯微鏡(德國(guó)蔡司光學(xué)設(shè)備有限公司)；日本產(chǎn)HITACHI S-3000N冷切發(fā)射掃描電鏡、H-7500透射電子顯微鏡(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心電鏡室)；STORZ 250420B電鉆，功率60 W(德國(guó)產(chǎn))；FP-6200酶標(biāo)儀(日本產(chǎn))；隔聲屏蔽室(南方醫(yī)科大珠江醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科聽(tīng)力中心)；手鉆(自制)，顯微鏡下將針灸銀針尖端1 mm打磨成三棱錐形制成；飛鴿牌微量進(jìn)樣器，25 μl(上海注射器三廠生產(chǎn))。

1.3研究方法

1.3.1各組動(dòng)物給藥方法及劑量 空白對(duì)照組鼓階開(kāi)窗微孔注入人工外淋巴液10 μl/d，連續(xù)給藥3天；GM組肌肉注射GM 160 mg·kg-1·d-1，連續(xù)注射3天；PPTA組鼓階開(kāi)窗微孔注入PPTA 10 μl/d，連續(xù)給藥3天，同時(shí)，肌肉注射GM 160 mg·kg-1·d-1。

1.3.2鼓階開(kāi)窗微孔注藥方法 豚鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)全身麻醉，雙耳備皮，保溫毯37 ℃保溫，5%碘酊消毒手術(shù)部位，鋪無(wú)菌巾單，0.5%鹽酸利多卡因局部麻醉，在耳廓根部后下1/3距耳后溝0.5 cm處切開(kāi)皮膚，分離肌肉組織，顯露顳骨乳突部，耳科電鉆(0.8 mm小鉆頭)在乳突上鉆孔，孔徑約2 mm，顯微鏡下孔內(nèi)可見(jiàn)耳蝸底回和圓窗，以圓窗下緣下方1.2 mm，距耳蝸與鼓室壁交界處1.5 mm的耳蝸底回用自制“耳蝸手鉆”旋轉(zhuǎn)鉆出直徑約0.2 mm微孔，即進(jìn)入鼓階。由微孔插入灌注針頭，入鼓階深<0.2 mm，微量注射器將10 μl PPTA(PPTA組)或等量人工外淋巴液(空白對(duì)照組)緩慢注入鼓階內(nèi)，并用肌漿和少許耳腦膠封閉骨孔。切口縫合后用創(chuàng)可貼包扎。

1.3.3聽(tīng)性腦干反應(yīng)檢測(cè) 三組動(dòng)物分別在用藥前、第3天用藥后測(cè)試聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)。測(cè)試在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，以1%戊巴比妥鈉溶液(35 mg/kg)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行腹腔注射麻醉。測(cè)試采用南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院聽(tīng)力中心的“聽(tīng)覺(jué)電生理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)”測(cè)聽(tīng)系統(tǒng)[4]。用短銀針(自制，極間阻抗<2 000 Ω)刺入豚鼠皮下作電極，顱頂雙耳連線正中點(diǎn)為記錄電極，受試耳后乳突皮下為參考電極，對(duì)側(cè)耳后乳突皮下為接地電極。耳機(jī)離受試耳外耳道口0.5 cm。用單周正弦波短聲(click)刺激，采樣重復(fù)頻率11.1次/s(刺激間隔90 ms)，交替起始位相以消除偽跡，濾波帶通100～3 000 Hz，疊加次數(shù)256～512次，分析時(shí)程20 ms，聲刺激重復(fù)率15 Hz，放大倍數(shù)100 000倍，刺激聲強(qiáng)級(jí)的增減為5 dB SPL。對(duì)側(cè)加低強(qiáng)度白噪聲(低于刺激聲20 dB SPL)掩蔽。以波Ⅲ確定豚鼠ABR的反應(yīng)閾(respond threshold，RT)，每只豚鼠反復(fù)測(cè)量三次取平均值作為該豚鼠RT。

1.3.4各組豚鼠耳蝸組織提取 最后一次ABR檢測(cè)結(jié)束后，各組豚鼠均斷頭處死，斷頭置于冰臺(tái)上，生理鹽水沖洗，迅速分離每只豚鼠的雙側(cè)顳骨，取聽(tīng)泡，打開(kāi)聽(tīng)泡，暴露鼓室，分離耳蝸，在解剖顯微鏡下去除鐙骨并刺破圓窗膜，蝸尖朝上，在蝸?lái)斻@孔，用微量注射器從蝸尖小孔緩慢注入PBS緩沖液，直至液體從從前庭階和鼓階流出。以分離針和小刀片剝離蝸殼，剔除骨迷路，一側(cè)組織留用SOD、GSH檢測(cè)。

1.3.5耳蝸組織SOD活力及GSH含量檢測(cè) 采用南京建成生物工程研究所SOD試劑盒 A001-1(羥胺法)和GSH試劑盒A006-1(100T/96樣)。取各組一側(cè)耳蝸組織置于冰臺(tái)上，預(yù)冷生理鹽水按重量體積比1:9，冰浴下用電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，制成10%耳蝸組織勻漿，3 000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，-20 ℃保存，組織蛋白濃度測(cè)定用BCA法，SOD、GSH測(cè)定按試劑盒步驟進(jìn)行。蛋白冷卻到室溫后，用酶標(biāo)儀測(cè)定A562，或540～590 nm 之間其他波長(zhǎng)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式計(jì)算總SOD活力(酶計(jì)算的為活力，單位U/mgprot，mgprot為毫克蛋白數(shù))。根據(jù)實(shí)驗(yàn)做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GSH濃度，單位Ggsh/L。

1.3.6掃描電鏡(SEM)標(biāo)本制備 取各組豚鼠另一側(cè)耳蝸中的7個(gè)耳蝸制作SEM標(biāo)本。用2.5%戊二醛由蝸尖向圓窗輕輕灌注10～15次后置于2.5%戊二醛固定液中固定24 h(控溫4 ℃)。標(biāo)本放入臨界點(diǎn)干燥儀內(nèi)進(jìn)行干燥，液態(tài)CO2作置換液；將干燥后的標(biāo)本在顯微鏡下用導(dǎo)電膠粘到銅座上，離子濺射儀鍍膜,掃描電鏡觀察。

1.3.7透射電鏡(TEM)標(biāo)本制備 取上述剩余8個(gè)耳蝸組織做TEM標(biāo)本。TEM樣品的制備需要經(jīng)過(guò)耳蝸內(nèi)1% 多聚甲醛和2% 戊二醛1:1 混合液灌流后，置于該混合液中4 ℃過(guò)夜；解剖顯微鏡下剝?nèi)ザ佂鈿?，?jīng)過(guò)漂洗、后固定、脫水、脫鈣、鋨酸后固定，包埋，切取半薄切片及60 nm左右的超薄切片。透射電鏡觀察耳蝸組織等超微結(jié)構(gòu)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用協(xié)方差分析方法，若實(shí)驗(yàn)前ABR反應(yīng)閾對(duì)實(shí)驗(yàn)后無(wú)影響，對(duì)實(shí)驗(yàn)后數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，若滿(mǎn)足方差齊性，用LSD比較組間差異；若不滿(mǎn)足方差齊性，用Welch法矯正，用Dunnet’s T3比較組間差異。計(jì)算概率值(P)顯示差異性，以P<0.05作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1各組動(dòng)物ABR反應(yīng)閾比較 各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前后ABR反應(yīng)閾比較見(jiàn)表1，可見(jiàn)空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后ABR反應(yīng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；用藥3天后GM組和PPTA組ABR反應(yīng)閾明顯高于空白對(duì)照組(P<0.001)，PPTA組ABR反應(yīng)閾顯著低于GM組(P<0.001)。

表1 三組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前后ABR 反應(yīng)閾值比較

注：*與空白對(duì)照組比較，P<0.01;#與GM組比較，P<0.01

2.2各組動(dòng)物用藥3天后耳蝸組織中SOD和GSH檢測(cè)結(jié)果 GM組耳蝸組織SOD活力顯著低于空白對(duì)照組(P<0.001)和PPTA組(P<0.001)，PPTA組耳蝸組織SOD與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.121)。三組間耳蝸組織GSH含量差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=170.740,P<0.001)，PPTA組耳蝸組織GSH顯著高于GM組(P<0.001)，但低于空白對(duì)照組(P<0.001)(表2)。

表2 各組用藥3天后SOD活力和GSH含量比較

注：*與空白對(duì)照組比較，P<0.001;#與GM組比較，P<0.001

2.3各組動(dòng)物耳蝸掃描電鏡結(jié)果 掃描電鏡觀察可見(jiàn)空白對(duì)照組耳蝸的三排外毛細(xì)胞纖毛直立，排列整齊，V型，無(wú)倒伏、缺失；內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊，無(wú)纖毛和胞體缺損(圖1a)。GM組耳蝸?zhàn)钔馀磐饷?xì)胞受損最嚴(yán)重，明顯腫脹、倒伏、斷裂，失去正常形態(tài)，損傷向內(nèi)逐漸減輕，以底回最重，向上逐漸減輕，內(nèi)毛細(xì)胞損傷較外毛細(xì)胞輕微(圖1b)；PPTA組耳蝸的外毛細(xì)胞腫脹，部分倒伏、較少斷裂缺失；內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊(圖1c)。

2.4各組動(dòng)物耳蝸透射電鏡結(jié)果 透射電鏡觀察可見(jiàn)空白對(duì)照組豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞呈試管狀，形態(tài)正常，胞膜光滑完整，胞內(nèi)無(wú)水腫、空泡和變性；內(nèi)毛細(xì)胞胞呈杯狀，核較外毛細(xì)胞大而圓(圖2a)；GM組耳蝸毛細(xì)胞水腫樣變性，線粒體腫脹，邊集，胞膜輕微外凸，胞膜下可見(jiàn)出小空泡，核固縮或胞質(zhì)消失，可見(jiàn)凋亡小體(圖2b)；PPTA組耳蝸病變明顯輕于GM組，毛細(xì)胞線粒體腫脹減輕，細(xì)胞形態(tài)基本正常(圖2c)。

圖1 各組動(dòng)物耳蝸掃描電鏡觀察結(jié)果 a 空白對(duì)照組;b GM組;c PPTA組

圖2 各組動(dòng)物耳蝸透射電鏡觀察結(jié)果 a 空白對(duì)照組;b GM組;c PPTA組

3 討論

感音神經(jīng)性聾嚴(yán)重影響著人類(lèi)身體健康和生活質(zhì)量，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，全世界近6億人有輕度聽(tīng)力損失，中度以上約2.5億[5]。我國(guó)有聽(tīng)障的殘疾人近3 000萬(wàn)，居各類(lèi)殘疾之首。耳蝸損傷是感音神經(jīng)性聾的主要病理改變，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞鈣超載、OFR等都可造成耳蝸損傷。OFR最外層的電子軌道上具有未配對(duì)電子，是生物體內(nèi)氧分子不完全還原代謝的產(chǎn)物，主要包括超氧陰離子、羥自由基(·OH)和過(guò)氧化亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)等。OFR直接或間接地發(fā)揮強(qiáng)氧化作用，廣泛地參與機(jī)體生理病理過(guò)程，被認(rèn)為是氧中毒、藥物中毒等病理過(guò)程的基礎(chǔ)[6]。AmAn致聾機(jī)制仍不十分清楚，隨著對(duì)耳蝸損傷研究的深入[7]， 越來(lái)越多證據(jù)顯示OFR參與了AmAn耳毒性的發(fā)生[8]，有證據(jù)顯示經(jīng)GM培養(yǎng)12 h耳蝸毛細(xì)胞出現(xiàn)大量的過(guò)氧化物陰離子[9]，提示OFR可能在GM致毛細(xì)胞早期損害中扮演重要角色。鑒于OFR在耳蝸損傷中的重要作用[10]，尋找OFR清除劑來(lái)治療感音神經(jīng)性聾具有重要的意義。

鹽酸椒苯酮胺(peperphentonamine hydrochloride,PPTA)系中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合成的鈣增敏劑類(lèi)原始創(chuàng)新化學(xué)藥，具有增強(qiáng)心臟功能并降低心肌耗氧量的雙重作用。其對(duì)心、腦組織的作用機(jī)制為清除損傷的心肌細(xì)胞氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[3]；清除腦細(xì)胞受損所產(chǎn)生的OFR，增加腦組織SOD活力和GSH含量[11]。前期研究顯示[12]，PPTA對(duì)動(dòng)物耳蝸缺血再灌注導(dǎo)致的聽(tīng)功能損傷具有保護(hù)作用。PPTA若通過(guò)傳統(tǒng)方式全身用藥，其對(duì)心臟功能、血液循環(huán)、肝腎代謝等影響可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)中耳蝸組織SOD、GSH的檢測(cè)，需要將PPTA直接導(dǎo)入耳蝸以排除對(duì)結(jié)果客觀性和準(zhǔn)確性的影響。近年來(lái)，鼓階開(kāi)窗已成為將基因、生長(zhǎng)因子等導(dǎo)入耳蝸的重要途徑，前期研究表明鼓階開(kāi)窗術(shù)對(duì)豚鼠聽(tīng)力無(wú)影響，不會(huì)導(dǎo)致耳蝸組織功能受損，可作為內(nèi)耳給藥的有效途徑[13]。故本研究選擇鼓階開(kāi)窗微孔注入技術(shù)將PPTA注入GM致聾豚鼠耳蝸，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后ABR反應(yīng)閾無(wú)明顯差異，提示鼓階開(kāi)窗微孔技術(shù)對(duì)聽(tīng)力無(wú)顯著影響，實(shí)驗(yàn)后GM組ABR反應(yīng)閾顯著高于正常組，PPTA組ABR反應(yīng)閾顯著低于GM組，提示PPTA對(duì)耳蝸功能具有的保護(hù)作用。耳蝸是氧代謝非常旺盛的器官之一，毛細(xì)胞、血管紋等結(jié)構(gòu)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等產(chǎn)生大量OFR，所以PPTA對(duì)耳蝸的保護(hù)機(jī)制可能與其在心、腦組織中的作用類(lèi)似。

SOD、GSH為機(jī)體維持氧化-抗氧化平衡的主要物質(zhì)。SOD、GSH廣泛存在于耳蝸血管紋、纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、螺旋韌帶及前庭等部位，并主要由肝、腎合成、代謝。SOD是生物體內(nèi)重要且最佳的OFR清除劑，其活性的高低間接反映組織清除OFR的能力，GSH為機(jī)體重要的解毒及抗氧化劑，除可與OFR結(jié)合、接受H使OFR的清除反應(yīng)能夠持續(xù)進(jìn)行[14]外，還可利用其半胱氨酸上巰基(-SH)還原SOD。一般認(rèn)為，OFR可能貫穿組織損傷的全過(guò)程，但因中晚期出現(xiàn)抗氧化物質(zhì)耗竭，故本研究于給藥3天后檢測(cè)耳蝸組織中的SOD和GSH，有利于客觀地分析耳蝸組織內(nèi)OFR水平。結(jié)果顯示，GM組SOD、GSH顯著低于正常組，提示GM組耳蝸組織OFR增多，有研究認(rèn)為GM可以和體內(nèi)的鐵離子形成具有較強(qiáng)氧化性的螯合物[15]而導(dǎo)致OFR過(guò)量增多，可能是本研究中GM組耳蝸中OFR增多的原因；PPTA組SOD、GSH顯著高于GM組，說(shuō)明該組動(dòng)物SOD、GSH消耗量較GM組少，提示PPTA具有清除耳蝸組織過(guò)量OFR的作用；另外，PPTA組與空白對(duì)照組比較，SOD無(wú)顯著差異而GSH降低，表明PPTA組可能有一部分SOD通過(guò)消耗GSH得到了補(bǔ)充。

從文中結(jié)果看，掃描電鏡下可見(jiàn)空白對(duì)照組毛細(xì)胞排列整齊，纖毛直立并具有極性，支持細(xì)胞整齊，可見(jiàn)鼓階開(kāi)窗微孔技術(shù)并未對(duì)耳蝸組織造成明顯影響；GM組外毛細(xì)胞損傷最為明顯，以底回最重，向上逐漸減輕，這與GM最先導(dǎo)致高頻聽(tīng)力損失相一致。毛細(xì)胞代謝旺盛是OFR主要集中的區(qū)域，掃描電鏡觀察顯示底回毛細(xì)胞損傷最重，原因在于耳蝸底部代謝強(qiáng)于頂部，產(chǎn)生更多OFR，從形態(tài)學(xué)方面也佐證了GM對(duì)耳蝸的OFR損傷機(jī)制；PPTA組耳蝸主要表現(xiàn)為毛細(xì)胞纖毛的腫脹，紊亂，極性存在，極少見(jiàn)纖毛的斷裂與缺失，其損傷程度明顯輕于GM組，表現(xiàn)出PPTA對(duì)耳蝸毛細(xì)胞等良好的保護(hù)作用。有研究表明OFR可能既參與了耳蝸組織細(xì)胞的凋亡途徑，也參與了耳蝸組織細(xì)胞的壞死途徑[16]。從文中透射電鏡結(jié)果看，GM組毛細(xì)胞泡狀腫脹，線粒體腫脹、嵴結(jié)構(gòu)消失、胞膜邊集。這些表現(xiàn)可能與OFR破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致能量代謝異常并鈣超載而產(chǎn)生細(xì)胞水腫有關(guān)；細(xì)胞膜皺縮，胞質(zhì)減少，染色質(zhì)凝聚在細(xì)胞核膜邊緣形成新月體，還發(fā)現(xiàn)調(diào)亡小體結(jié)構(gòu)。說(shuō)明凋亡是GM耳毒性導(dǎo)致耳蝸細(xì)胞損傷死亡的一種重要方式；PPTA組除細(xì)胞部分空泡樣變外，損傷表現(xiàn)并不顯著，線粒體腫脹明顯弱于GM組，表明PPTA對(duì)耳蝸組織細(xì)胞有良好的抗壞死和抗凋亡作用。

綜上所述，OFR是GM導(dǎo)致耳蝸功能受損的重要原因，PPTA通過(guò)拮抗GM所致OFR損傷耳蝸的機(jī)制起到保護(hù)聽(tīng)力的作用。其可能機(jī)制為：①PPTA通過(guò)直接或間接清除OFR保護(hù)SOD活力，保護(hù)了組織抗氧化能力。②抗組織過(guò)氧化：GSH可結(jié)合OFR并將氧化后SOD等進(jìn)行還原，其含量是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。③阻止了OFR引起的細(xì)胞凋亡和壞死，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

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