崔小緩 張延平 張曉強(qiáng) 李麗娜 蔣興旺

研究發(fā)現(xiàn) 50 %的家族性遺傳性常染色體隱性非綜合征性聾(nonsyndromic hearing loss , NSHL) 以及 15 %～30 %的散發(fā) NSHL 都可檢測到 GJB2 基因突變[1]，至今，已證明有120多種不同的GJB2基因突變與NSHL有關(guān)[2]。在未成年NSHL患者中GJB2基因突變的陽性檢出率高達(dá)20. 1 %[3]，因此該基因突變是導(dǎo)致人類NSHL的主要原因之一[4]，但其致病機(jī)制尚不清楚。

至今有三種GJB2基因條件敲除小鼠報(bào)道,即cCx26OtogCre(Cx26loxP/loxP_OtogCre)[5]、 cCx26Pax2Cre( Cx26loxP/loxP_Pax2Cre)[6]和cCx26foxg1Cre(Cx26loxP/loxP_foxg1Cre)[6]。這些模型動物在聽功能發(fā)育成熟后出現(xiàn)耳蝸細(xì)胞的大面積缺失，前期研究結(jié)果提示cCx26OtogCre小鼠在P17時半胱天冬酶3(caspase-3)表達(dá)陽性[5]，在P18時耳蝸外毛細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡表現(xiàn)[7]，提示其毛細(xì)胞凋亡可能是GJB2基因敲除后耳蝸細(xì)胞缺失的主要原因，但是目前有關(guān)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚未見報(bào)道。為了進(jìn)一步探索GJB2基因突變導(dǎo)致耳蝸細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)芯片(QRT-PCR Array)技術(shù)對cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸膜迷路細(xì)胞中凋亡相關(guān)的84個基因差異性表達(dá)情況進(jìn)行分析，探討GJB2基因突變導(dǎo)致耳聾的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 轉(zhuǎn)基因小鼠Cx26loxp/loxp和Pax2-Cre/+從美國Emory大學(xué)林曦教授實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)，cCx26Pax2Cre小鼠由Cx26loxp/-_Pax2Cre/+和Cx26loxp/loxp小鼠雜交產(chǎn)生。cCx26Pax2Cre小鼠為實(shí)驗(yàn)組，野生型BALB/C小鼠作為正常對照組，兩組各選取P10和P18小鼠各3只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)動物的實(shí)驗(yàn)方法得到309醫(yī)院動物飼養(yǎng)和使用委員會批準(zhǔn)。

1.2主要試劑和儀器 RNeasy?Microarray Tissue 試劑盒、RNase-Free Dnase試劑盒、RT2 First Strand試劑盒、RT2Profiler PCR Array 試劑盒均為美國凱杰公司產(chǎn)品。所用的實(shí)時熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)。

1.3QRT-PCR Array檢測耳蝸膜迷路凋亡相關(guān)基因的差異性表達(dá)方法 取野生型或cCx26Pax2Cre小鼠，麻醉后斷頭取耳蝸，解剖顯微鏡下打開耳蝸骨質(zhì)取耳蝸膜迷路立刻放進(jìn)裂解液中，充分研磨，按照凱杰公司的試劑盒說明書提取RNA，測定RNA濃度和純度；再行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，應(yīng)用QRT-PCR Array進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 首先將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成Excel文件，上傳至凱杰公司網(wǎng)站(http://www.sabiosciences.com)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖形繪制。數(shù)據(jù)分析采用△△Ct方法，通過2-△△Ct計(jì)算比較每組對應(yīng)基因表達(dá)差異，應(yīng)用student T-test可信區(qū)間為95%,P<0.05且上述基因表達(dá)差異在2倍以上為表達(dá)差異具有生物學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1P18與P10野生型小鼠耳蝸膜迷路凋亡相關(guān)基因差異性表達(dá)比較 P18較P10時野生型小鼠耳蝸膜迷路有7個凋亡相關(guān)基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)(8.33%，7/84)(表1)，Bak1、Bok、Casp2、Ltbr為促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(57%，4/7)，CD40，Bcl2l10、Bnip3l為抑制細(xì)胞凋亡的基因(43%，3/7)。

表1 不同膜迷路凋亡相關(guān)基因在P18與P10小鼠表達(dá)的差異倍數(shù)

2.2cCx26Pax2Cre小鼠與野生型小鼠耳蝸膜迷路凋亡相關(guān)基因差異性表達(dá)比較(表2) 與野生型小鼠相比，在P10時，cCx26Pax2Cre小鼠一共有16個基因表達(dá)有生物學(xué)意義(19.05%, 16/84)，其中14個基因表達(dá)下調(diào)(87.5%, 14/16)，包括9個(Bcl2l10、Naip1、Naip2、Birc3、Birc5、Hells、Nol3、Pak7、CD40)抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因(64%，9/14)，5個(Casp1、Casp12、Casp14、Tsc22d3、Trp53inp1)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)炎癥反應(yīng)的基因(36%，5/14)；2個基因(Dapk1，Tnfsf10b)表達(dá)上調(diào)(12.5%，2/16)，均為促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因(100%，2/2)，此期促進(jìn)細(xì)胞凋亡的趨勢十分明顯。在P18時，與野生型小鼠相比，cCx26Pax2Cre小鼠一共有4個基因(4.76%，4/84)表達(dá)變化有生物學(xué)意義，其中3個基因表達(dá)下調(diào)(75%，3/4)，并且全部為抑制細(xì)胞凋亡的基因(Bcl2l1、Bcl2l10、Cd40lg)，1個基因(Tnfrsf10b )表達(dá)上調(diào)(25%，1/4)，為促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，總體趨勢仍為促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

表2 不同時期耳蝸凋亡相關(guān)基因在cCx26Pax2Cre與野生型小鼠表達(dá)的差異倍數(shù)

注：※該基因表達(dá)在兩個時間點(diǎn)均變化

表3 凋亡相關(guān)基因在P18與P10小鼠表達(dá)的差異倍數(shù)

2.3P18與P10 cCx26Pax2Cre小鼠凋亡相關(guān)基因差異表達(dá)比較 與P10相比，P18 cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸膜迷路凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化有生物學(xué)意義的有6個基因(7.14%，6/84)，其中2個基因表達(dá)上調(diào)(33.3%，2/6)，分別為抑制細(xì)胞凋亡的Nol3和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的caspase-8基因，4個基因表達(dá)下調(diào)(66.7%，4/6)，分別為促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Tnfrsf10b、Cideb基因(50%，2/4)和抑制細(xì)胞凋亡的CD40、Bcl10基因(50%，2/4)(表3)。

3 討論

基因敲除小鼠是研究基因突變致病機(jī)制的良好工具，有研究對cCx26OtogCre小鼠TUNEL標(biāo)記耳蝸后進(jìn)行觀察，提示從 P14開始，Corti 器細(xì)胞標(biāo)記陽性，從內(nèi)毛 細(xì) 胞 的 支 持 細(xì) 胞 開 始 逐 漸 蔓延到外毛細(xì)胞的支持 細(xì) 胞， 然后是外毛細(xì)胞以及其他細(xì)胞，并且P17小鼠耳蝸中檢測到caspase-3表達(dá)陽性[5]。張延平等[7]用異硫氰酸熒光素標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(fluorescein isothiocyanate-phalloidin，F(xiàn)ITC-phalloidin)及碘化丙啶(propidium iodide，PI)對cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸基底膜染色，發(fā)現(xiàn)P18小鼠耳蝸外毛細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡表現(xiàn)，上述結(jié)果都提示GJB2基因條件敲除后小鼠耳蝸細(xì)胞缺失可能主要以凋亡的形式表現(xiàn)。

凋亡相關(guān)的84個基因存在于凋亡三大通路中，其中55個是促進(jìn)凋亡基因，29個為抑制凋亡的基因，這些基因的表達(dá)變化可以較為全面地反應(yīng)組織中細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況。Hu等[8]應(yīng)用QRT-PCR Array技術(shù)對噪聲暴露后大鼠耳蝸感覺上皮細(xì)胞和外側(cè)壁(螺旋韌帶、螺旋凸和血管紋)凋亡相關(guān)84個基因表達(dá)變化進(jìn)行分析；Wei等[9]也應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)對水楊酸干預(yù)后的大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)凋亡相關(guān)84個基因表達(dá)變化進(jìn)行了分析。由此可見這項(xiàng)技術(shù)用于動物模型耳蝸凋亡相關(guān)基因的篩查已經(jīng)比較成熟。P9是小鼠耳蝸出生后發(fā)育的關(guān)鍵時期，此時柯替氏隧道打開，耳蝸發(fā)育趨于成熟。前期研究發(fā)現(xiàn)cCx26Pax2Cre小鼠 P18 時外毛細(xì)胞出現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)[7]，因此，本研究應(yīng)用QRT—PCR Array技術(shù)選擇動物耳蝸形態(tài)學(xué)表現(xiàn)剛有差異的P10與細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡現(xiàn)象的P18兩個時間點(diǎn)對其耳蝸膜迷路凋亡相關(guān)的84個基因表達(dá)差異性進(jìn)行研究，以探討GJB2基因突變導(dǎo)致耳聾的機(jī)制。

本研究顯示，P18野生型小鼠較P10時耳蝸膜迷路有7個調(diào)亡相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，包括4個促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、3個抑制細(xì)胞凋亡的基因。提示野生型小鼠耳蝸膜迷路細(xì)胞在發(fā)育過程中可能存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，可能在P9時耳蝸螺旋器柯替氏隧道打開，把不需要的細(xì)胞舍棄，形成正常的聽功能過程；而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)可能提示在P18時野生型小鼠耳蝸膜迷路細(xì)胞內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)定，這與形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)此時期野生型小鼠耳蝸膜迷路發(fā)育基本成熟相一致。

文中結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，P10 cCx 26Pax2Cre小鼠有生物學(xué)意義差異的表達(dá)基因數(shù)較多，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡的趨勢十分明顯，P18時細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)差異數(shù)較P10時明顯減少，主要趨勢仍為促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且所有的基因表達(dá)差異均促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這可能與此期耳蝸外毛細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡缺失有關(guān)。Bcl2l10和Tnfrsf10b基因在P10和P18兩個發(fā)育階段的變化均具有生物學(xué)意義，Bcl2l10編碼的蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，在兩個階段均下調(diào)；Tnfrsf10b編碼的蛋白主要生物學(xué)功能為促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在兩個階段均上調(diào)，提示可能Bcl2l10和Tnfrsf10b這兩個基因在cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸膜迷路細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。

本研究顯示，P18 cCx26Pax2Cre小鼠較P10時促進(jìn)細(xì)胞凋亡的趨勢減弱，可能是cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸膜迷路細(xì)胞在P18時出現(xiàn)了凋亡相關(guān)基因表達(dá)重新整合，使細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境趨于新的平衡。然而此期促進(jìn)細(xì)胞凋亡的caspase-8仍表達(dá)上調(diào)2倍以上(P<0.05)，提示caspase-8在cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸膜迷路細(xì)胞凋亡過程中可能起重要作用。

Tnfrsf10b編碼DR5,屬于腫瘤壞死因子受體(tumor nercrosis factor receptor, TNFR)超家族成員，其與相應(yīng)配體結(jié)合引起前者寡聚化而被激活，被激活的死亡受體招集FADD(Fas-associated death domain, FADD)分子誘導(dǎo)凋亡。FADD通過兩個DD之間的互相作用于受體，通過DED之間的相互作用募集Caspase-8(Pro-caspase-8)，最后形成一個死亡信號復(fù)合體(death-inducing signaling complex，DISC )[10],在DISC內(nèi)，Pro-caspase-8被激活，形成Caspase-8，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡?，F(xiàn)在研究者普遍認(rèn)為[11]Caspase-8引發(fā)凋亡主要通過兩個途徑，即非線粒體依賴途徑和線粒體依賴途徑。Bcl2l10是BCI-2家族最近被發(fā)現(xiàn)的蛋白成員，研究認(rèn)為Bcl2l10編碼的蛋白主要作用為抑制細(xì)胞凋亡；Bcl2l10基因過表達(dá)，可能通過阻止cytochrome C激活Caspase-3抑制細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)Bcl2l10減少可以通過B細(xì)胞淋巴瘤因子相關(guān)X蛋白(B cell lymphoma factor related protein X,BAX)途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)Tnfrsf10b和Bcl2l10基因在小鼠出生后的P10和P18均出現(xiàn)一致性上調(diào)或下調(diào)，而且與P10相比，P18時cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸組織Caspase-8表達(dá)明顯增加，推測DR5與Pro-caspase-8形成DISC后活化Caspase-8并最終通過死亡受體途徑直接引起細(xì)胞凋亡，而同時caspase-8被激活后裂解Bid[BH interacting (with BCL 2 family) domain,BCL2家族BH作用結(jié)構(gòu)域]使得有活性的截短Bid(truncated Bid,tBid)生成增加，tBid增加和Bcl2l10表達(dá)下調(diào)都導(dǎo)致Bax表達(dá)上調(diào)，激活線粒體通路導(dǎo)致細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyto C)和Smac/DIABLO釋放，Cyto C釋放入胞漿, 與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor,Apa-f1)、pro-caspase-9形成凋亡體, 使得pro-caspase-9自身催化形成有活性的Caspase-9, 進(jìn)而活化效應(yīng)Caspase-3、Caspase-7，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。GJB2基因敲除后，可能通過上調(diào)DR5，直接激活凋亡通路的死亡受體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，也可能通過Caspase-8間接激活線粒體通路使凋亡信號進(jìn)一步放大，最終引起cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸細(xì)胞的廣泛缺失和聽力下降。有關(guān)DR5導(dǎo)致GJB2基因敲除小鼠耳蝸細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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