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(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,河南 鄭州 450002；2.河南省許昌市煙草公司,河南 許昌 461000；3.河南省襄城縣煙草公司,河南 襄城 452670)

我國(guó)耕地面積少，作物連作現(xiàn)象十分普遍。煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,也是一種忌連作作物，但由于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)烤煙連作在煙葉生產(chǎn)中十分普遍。煙草連作常導(dǎo)致煙株生長(zhǎng)發(fā)育不良，品質(zhì)及產(chǎn)量下降，抗病能力降低，土傳病害加重[1-2]。

土壤微生物作為土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的動(dòng)力，直接關(guān)系到土壤養(yǎng)分的有效性，對(duì)作物的正常生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用[3-4]。土壤微生物中以細(xì)菌的種類(lèi)和數(shù)量最多[5]，土壤細(xì)菌的多樣性能夠反映特定土壤環(huán)境的歷史情況[6]。土壤酶來(lái)自微生物、植物和動(dòng)物的活體或殘?bào)w，通過(guò)催化土壤中的生化反應(yīng)發(fā)揮重要作用，保持了土壤生物化學(xué)的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，其活性與土壤的理化性質(zhì)和其他生物學(xué)特征緊密相關(guān)，是近年來(lái)土壤質(zhì)量評(píng)估指標(biāo)中必不可少的內(nèi)容[7-9]。土壤蔗糖酶、淀粉酶 、纖維素酶廣泛存在于土壤中，它們直接參與土壤有機(jī)質(zhì)的代謝過(guò)程，與土壤肥力密切相關(guān),是評(píng)價(jià)土壤肥力的重要指標(biāo)之一，并能部分反映土壤生產(chǎn)力[10-13]。

研究試圖利用常規(guī)方法結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)，系統(tǒng)分析了烤煙連作對(duì)土壤細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量和3種土壤酶活性的影響規(guī)律，以期為煙田土壤的可持續(xù)利用和克服連作障礙提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)土壤樣品于2011年9月采自許昌市襄城縣庾河村(GPS信息：33.99°N，113.56°E，H：113 m)連作1a-8a的21塊煙田，其中煙草連作1a-6a土樣各3個(gè)、連作8a土樣3個(gè)，但沒(méi)有采集到連作7a的土樣。采樣時(shí)遵循隨機(jī)、等量、多點(diǎn)混合的原則，采用S形布點(diǎn)取樣，每塊田地取15個(gè)小樣混合，土樣取自0 ～ 20 cm深的耕層土，共3份平行樣。一部分土樣裝入無(wú)菌紙袋，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，研磨過(guò)0.9 mm(20目)篩后于4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物的分析；另一部分土樣風(fēng)干，用于測(cè)定土壤酶活性。采樣煙田分布于相同的農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)域內(nèi)，施肥和田間管理均按照當(dāng)?shù)責(zé)煵萆a(chǎn)技術(shù)規(guī)程進(jìn)行，烤煙品種均為中煙100。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1土壤酶活性的測(cè)定。淀粉酶、蔗糖酶、纖維素酶活性的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[14]。

1.2.2土壤微生物種群、數(shù)量的常規(guī)分離分析。菌分離采用1/10 TSA培養(yǎng)基，真菌分離采用PDA+Kana(卡那霉素0.005 mg·ml-1)培養(yǎng)基，放線菌分離采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基。土壤細(xì)菌、真菌、放線菌的計(jì)數(shù)采用稀釋涂抹平板法[15]。

1.2.3土壤樣品DNA的提取。本實(shí)驗(yàn)室方法提取土壤樣品總DNA，稱(chēng)取大約3 g土樣于10 mL離心管中；加入6 mL TENP buffer(50 mmol·L-1Tris，20 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1NaCl，0.01 g·mL-1PVPP，pH值10),渦旋震蕩10 min，12 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液；沉淀中加入6 mL PBS buffer(8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，溶于1 L水，pH值7.4)，渦旋震蕩5 min，12 000 r·min-1離心5 min,棄去上清液,沉淀備用；將沉淀中加入3 mL土壤DNA提取液(100 mmol·L-1Tris·HCl，100 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液，1.5 mol·L-1NaCl，1%CTAB，2%CaCl，1 ug·mL-1BSA，pH值8.0)，震蕩混勻后置于超低溫冰箱中冷凍15 min，65℃水浴5 min,然后充分反復(fù)凍融3次。向反復(fù)凍融的土壤中加入溶菌酶(100 mg·mL-1，50 uL)、蝸牛酶(20 mg·mL-1，100 uL)，37℃水浴1 h,再加入2.0 mg(100 mg·Ml-1，吸取20 uL)蛋白酶K，37℃水浴30 min；加入500 uL裂解液(20%SDS)，人工輕緩顛倒幾次至液體變粘稠，65℃水浴1 h，12 000 r·min-1(4℃)離心5 min，收集上清液；將上清液中加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，冰浴上人工晃動(dòng)5min,取上清液；在上清液中加入0.5倍體積25%PEG8000，4℃放置2 h(或過(guò)夜沉淀)；12 000 r·min-1(4℃)離心10 min，沉淀用75%乙醇洗滌2次，8 000 r·min-1( 4℃)離心5 min,沉淀室溫晾干，根據(jù)DNA得量溶于60 uL～100 uL TE 緩沖液。

1.2.4細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)的擴(kuò)增。據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)的細(xì)菌基因組16S保守序列設(shè)計(jì)了2對(duì)細(xì)菌通用引物,并進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。其中第一輪PCR的引物對(duì)為Eubac 10F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和Eubac 1507R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1.5 kbp。擴(kuò)增反應(yīng)體系25 ul，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，28個(gè)循環(huán)；72℃總延伸10 min。第二輪擴(kuò)增以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)引物對(duì)BV34F(5’-TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’)和BV56GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCGAATTAAACCACATGCTCCAGCAATTAAACCACATGCTCCA-3’)，產(chǎn)物長(zhǎng)度約為400 bp。第2輪PCR反應(yīng)體系50 ul，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 40 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，28個(gè)循環(huán)；72℃總延伸10 min。

1.2.5變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。GGE參數(shù)為：變性劑(尿素及去離子甲酰胺)梯度40%到60%，8%的聚丙烯酰胺凝膠。點(diǎn)樣量為30 uL已濃縮PCR產(chǎn)物，電泳在60℃，1倍 TAE(pH 8.0)緩沖液，100V電壓下進(jìn)行10 h。電泳結(jié)束后在EB中染色15 min，并用BIO IMAGING(美國(guó)UVP GelDoc-It Imaging Systems)的凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與分析。驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，并進(jìn)行Duncan法方差分析；用Quantity One軟件(Bio-Rad)對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理[16]，按照如下公式計(jì)算多樣性指數(shù)Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、McIntosh多樣性指數(shù)[17]。其中：s——每泳道中的條帶數(shù)量；Pi——泳道中第i條帶灰度(height of the peak)占該泳道總灰度的比例；ni——泳道中第i條帶灰度；N——每泳道中所有條帶的總灰度。

Simpson指數(shù)：

Shannon-Wiener指數(shù)：

McIntosh多樣性指數(shù)：

2 結(jié)果與分析

2.1 連作年限對(duì)土壤酶活性的影響

連作1 a-8 a土壤蔗糖酶活性整體呈現(xiàn)先升高后下降再略有回升的趨勢(shì)，連作2 a時(shí)土壤蔗糖酶活性達(dá)到最大值，之后顯著降低(p<0.01)，并在連作第6 a達(dá)到最低，到第8 a又顯著增加，見(jiàn)圖1。此外，連作2 a、3 a蔗糖酶活性與其他連作年限相比差異達(dá)到極顯著水平(p<0.01)，而連作4 a、5 a和6 a的蔗糖酶活性并無(wú)顯明差異，連作8 a蔗糖酶活性與連作5 a、6 a相比達(dá)到極限著差異(p<0.01)。

圖1 不同連作年限土壤酶活性的變化Fig.1 The changes of soil enzyme activities during different continuous cropping years注：酶和淀粉酶標(biāo)于主坐標(biāo)軸，纖維素酶標(biāo)于次坐標(biāo)軸。

土壤淀粉酶活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，在連作2 a時(shí)達(dá)到最大值，與連作1a酶活性相比并無(wú)顯著差異，但與其它連作年限相比差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)；連作4 a-8 a的土壤淀粉酶活無(wú)顯著性差異。

土壤纖維素酶活性在連作1 a-3 a時(shí)劇烈下降，連作1 a、2 a時(shí)的纖維素酶活性與其他連作年限相比存在顯著差異(p<0.05)；連作1 a時(shí)最高，連作年限達(dá)到3 a以后，土壤纖維素酶活性呈相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2 不同連作年限的植煙土壤微生物學(xué)特征常規(guī)分離結(jié)果

土壤細(xì)菌數(shù)量隨連作年限的延長(zhǎng)，總體呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，見(jiàn)圖2；且連作1 a的煙田土壤細(xì)菌數(shù)量最多，與其他連作年限(連作5 a除外)有顯著差異(p<0.05)；連作5 a的細(xì)菌數(shù)量與連作3 a、6 a和8 a達(dá)到顯著差異(p<0.05)。

從圖2可以看出，土壤真菌隨著連作年限的增加其數(shù)量變化趨勢(shì)為升高-降低-升高-降低；連作3 a之前，土壤真菌數(shù)量逐漸增多，連作4 a、5 a數(shù)量有所增加，5 a之后再次減少。其中，連作3 a真菌數(shù)量與連作1 a和8 a達(dá)到顯著差異(p<0.05)；連作6 a與8 a達(dá)到顯著差異(p<0.05)。

圖2 不同連作年限土壤微生物數(shù)量的變化Fig.2 The changes of soil microbial number during different continuous cropping years

由圖2可知，隨著連作年限的延長(zhǎng)，土壤放線菌數(shù)量總體上逐漸減少，其變化趨勢(shì)與細(xì)菌相似，且連作3 a后，其數(shù)量顯著下降，之后趨于平穩(wěn)；試驗(yàn)結(jié)果表明，連作1 a、2 a和3 a放線菌數(shù)量接近同一水平，且與其他連作年限差異顯著(p<0.05)；連作4 a、5 a、6 a和8 a之間無(wú)顯著性差異(p<0.05)。

2.3 不同連作年限土壤細(xì)菌的PCR擴(kuò)增

細(xì)菌16S rDNA的第一輪PCR擴(kuò)增條帶亮度高，大小約為1 500 bp，陰性對(duì)照無(wú)條帶，且無(wú)非特異性擴(kuò)增，見(jiàn)圖3。第二輪擴(kuò)增的細(xì)菌V3區(qū)條帶片段的大小約為400 bp，陰性對(duì)照無(wú)條帶，且無(wú)非特異性擴(kuò)增，見(jiàn)圖4，能夠滿(mǎn)足進(jìn)一步的DGGE分析要求。

2.4 不同連作年限煙田土樣的細(xì)菌的DGGE分析

連作1 a-8 a的DNA泳道中條帶的個(gè)數(shù)和亮度不一，說(shuō)明不同連作年限土壤樣品的細(xì)菌多樣性不同，見(jiàn)圖5。連作1 a-8 a的土樣中多樣性條帶數(shù)量在11條～17條不等，且隨著連作年限的延長(zhǎng)，條帶數(shù)逐漸減少。其中連作1 a的條帶數(shù)最多，達(dá)到17條，連作8 a的條帶數(shù)最少，只有11條，但連作5 a樣品的條帶數(shù)多于4 a和6 a樣品，5 a后繼續(xù)減少。說(shuō)明土壤細(xì)菌豐富度(S)隨植煙年限的增加呈下降趨勢(shì)。

Shannon指數(shù)主要反映物種的豐富度,描述了土壤微生物群落功能多樣性相對(duì)多度的信息。由表1可以看出，不同連作年限之間的土樣的微生物的Shannon指數(shù)均存在極顯著差異(p<0.01)，且連作1 a、2 a其值較大，之后有降低的趨勢(shì)，而到連作5a時(shí)，又有所上升。Simpson指數(shù)反映了群落中常見(jiàn)的物種多少。不同連作年限之間土樣的微生物的Simpson指數(shù)均存在極顯著差異(p<0.01)。Mcintosh多樣性指數(shù)基于群落物種多維空間上的多樣性指數(shù)。不同連作年限之間的土樣的微生物的Mcintosh指數(shù)均存在極顯著差異(p<0.01)。

圖3 連作1 a-8 a土樣細(xì)菌總DNA的第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The first round PCR amplification result of soil bacteria DNA during different continuous cropping years of 1-8注：M：DL 2000 DNA Marker；1 a-8 a分別表示連作1年- 8年的煙田土樣；N：陰性對(duì)照

圖4 連作1 a-8 a土樣細(xì)菌總DNA的第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 The second round PCR amplification result of soil bacteria DNA during different continuous cropping years of 1-8注：M：DL 2000 DNA Marker；1 a-8 a分別表示連作1年-8年的煙田土樣；N：陰性對(duì)照

連作年限Continuous years香農(nóng)指數(shù)Shannon(H)辛普森指數(shù)Simpson(J)McIntosh多樣性指數(shù)McIntosh(Dmc)1 a4.066 6 A0.939 6 A0.760 4 A2 a3.973 0 B0.935 2 B0.752 2 B3 a3.877 3 D0.930 8 D0.743 7 D4 a3.659 7 F0.918 8 F0.721 7 F5 a3.968 3 C0.934 8 C0.751 5 C6 a3.674 5 E0.920 5 E0.725 0 E8 a3.420 3 G0.904 3 G0.698 0 G

圖5 不同連作年限煙田土壤細(xì)菌群落V3區(qū)的DGGE指紋圖譜Fig.5 The DGGE finger-print of soil microbial V3 area during different continuous cropping years注：1 a-8 a分別表示連作1年-8年的煙田土樣

3 討論與結(jié)論

土壤酶作為衡量土壤健康狀況的一個(gè)必不可少的土壤微生物學(xué)指標(biāo)之一，越來(lái)越受到人們的高度重視，許多研究者在連作對(duì)土壤酶影響方面也進(jìn)行了很多研究。試驗(yàn)研究表明，短期連作(連作2 a-3 a)可使土壤淀粉酶和蔗糖酶活性升高；連作3 a以上時(shí)，兩種酶活性顯著下降，處于較低水平，與賈新民等[18]、何川等[19]的結(jié)果相似；而纖維素酶呈持續(xù)下降趨勢(shì)，結(jié)果與胡汝曉等[20]研究結(jié)果一致。

土壤微生物在反映土壤質(zhì)量狀況上有較高的靈敏度，是近年來(lái)研究土壤健康狀況不可或缺的生物學(xué)指標(biāo)[21]。眾多研究表明，連作可使土壤微生物數(shù)量和類(lèi)群發(fā)生變化[22-24]。試驗(yàn)采用常規(guī)分離培養(yǎng)和分子技術(shù)兩種手段，研究不同連作年限間土壤微生物多樣性的變化。結(jié)果表明隨著連作年限的延長(zhǎng)土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量逐漸減少，其中細(xì)菌數(shù)量降低尤為明顯，對(duì)連作表現(xiàn)出較高的敏感性,放線菌對(duì)連作反應(yīng)稍滯后,至第3 a時(shí)開(kāi)始呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，該結(jié)果與胡元森等[25]的研究結(jié)果極其相似；放線菌數(shù)量變化之所以較穩(wěn)定，可能是由于放線菌與細(xì)菌相比，生長(zhǎng)較慢、受農(nóng)業(yè)技術(shù)措施的影響小也表現(xiàn)較慢的緣故[26]。而真菌數(shù)量的變化與與細(xì)菌數(shù)量變化村存在此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，與古戰(zhàn)朝等[27]結(jié)果相似?？傮w上，隨著連作年限的增加，土壤微生物種類(lèi)和數(shù)量、土壤酶活性呈下降趨勢(shì)，細(xì)菌和放線菌在微生物中所占的比例也呈下降趨勢(shì)，而真菌所占比例有所上升。一方面可能是因?yàn)檫B作導(dǎo)致土壤中養(yǎng)分含量失衡，造成土壤貧瘠，更適宜真菌生長(zhǎng)[28]；另一方面可能是由于土壤根系分泌物抑制土壤微生物生長(zhǎng)發(fā)育造成的，而細(xì)菌和放線菌對(duì)此反應(yīng)較為敏感，真菌對(duì)此反應(yīng)不太敏感，導(dǎo)致土壤微生物中真菌比例增加。

根據(jù)細(xì)菌16S rDNA的PCR-DGGE圖譜中條帶的位置和亮度的數(shù)字化結(jié)果計(jì)算了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指標(biāo)。連作1 a -8 a的條帶數(shù)11條 ～ 17條不等，且隨著植煙年限的延長(zhǎng)，條帶數(shù)逐漸減少，而到達(dá)5 a時(shí)條帶數(shù)增加，5 a后減少。不同連作年限的變化規(guī)律相同，均隨著連作年限的延長(zhǎng)，土樣的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh多樣性指數(shù)均在不斷下降，而到第5 a又有所回升，之后繼續(xù)下降，到第8 a降到最低。這與細(xì)菌的常規(guī)分離培養(yǎng)方法結(jié)果吻合。

煙草連作對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響與對(duì)土壤酶活性的影響具有一致性?？赡苁怯捎跓煵葸B作引起了土壤微生物主要類(lèi)群發(fā)生定向改變，進(jìn)而導(dǎo)致主要土壤酶活性的定向改變，這種改變將導(dǎo)致土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)轉(zhuǎn)化受到影響。

研究認(rèn)為煙草連作年限應(yīng)在3 a以下，此年限內(nèi)土壤微生物的多樣性和活性較高。

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