吳珊珊，朱蕓，陳珊珊，何冰芳

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816）

隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及生物信息學(xué)迅速發(fā)展，重組蛋白技術(shù)日漸成熟，重組蛋白已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域。然而，大規(guī)模生產(chǎn)性狀確切的活性蛋白仍是重組蛋白技術(shù)中的瓶頸問題。重組蛋白質(zhì)異源表達(dá)中有超過半數(shù)以上是以包涵體形式存在的。使用真核表達(dá)體系如酵母、昆蟲、哺乳類動物細(xì)胞表達(dá)體系是一種通用的解決方法，但是過程繁瑣，周期較長。而大腸桿菌以其背景清晰、生長快速、表達(dá)量大，易于操作仍為最常用的宿主。采用低溫誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白可以減少包涵體的形成，但是很多情況下并不適用。20世紀(jì)末，融合標(biāo)簽技術(shù)的興起為重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)帶來了福音。新融合標(biāo)簽的開發(fā)和利用使融合標(biāo)簽技術(shù)不僅局限用于蛋白質(zhì)的純化和檢測，而且在提高重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)中得到廣泛應(yīng)用。

融合標(biāo)簽?zāi)茉黾又亟M蛋白表達(dá)量或在蛋白質(zhì)折疊過程起作用，增強重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)[1]，這些融合標(biāo)簽大多是蛋白質(zhì)，僅有少數(shù)是多肽片段（見表1）。研究表明某些高度可溶的蛋白質(zhì)在與其它易形成包涵體的蛋白質(zhì)融合后會促進融合蛋白質(zhì)以可溶形式表達(dá)，這類蛋白主要有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST），麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP），硫氧還蛋白A（TrxA），轉(zhuǎn)錄終止抗終止因子（NusA），蛋白二硫鍵折疊異構(gòu)酶（DsbA）等（表1）。GST和MBP是發(fā)展最早的融合標(biāo)簽，1988年 Smith等[2]和Duplay等[3]分別使用GST和MBP融合表達(dá)重組蛋白并使用親和層析實現(xiàn)一步純化。后續(xù)研究表明GST提高重組蛋白溶解性能力有限，導(dǎo)致不溶性的因素尚不清楚，而不溶性的蛋白融合 MBP后常以可溶形式表達(dá)[4]。研究者在平行比較中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)情況下，MBP提高重組蛋白溶解性能力是最強，NusA與 MBP提高溶解性能力相當(dāng)[5-6]，有些研究認(rèn)為 TrxA也具有相當(dāng)?shù)奶岣咧亟M蛋白溶解性的能力[5]。另外，對于一些含有二硫鍵的蛋白， DsbA能夠發(fā)揮很好的作用[1]。

近幾年來一些新的提高重組蛋白溶解性的融合標(biāo)簽嶄露頭角。2004年，Malakhov等[7]研究發(fā)現(xiàn)SUMO（泛素相關(guān)小修飾蛋白）能夠促進蛋白正確折疊和結(jié)合穩(wěn)定，從而提高蛋白溶解性。雖然SUMO不能作為純化標(biāo)簽一步純化，但是其優(yōu)勢在于它本身是一個專一性的蛋白酶，能將SUMO標(biāo)簽除去。Invitrogen公司在2004年開發(fā)了一種新型的增強可溶性表達(dá)的多肽標(biāo)簽（SET），該標(biāo)簽可能是通過靜電排斥來防止新生多肽相互聚集[8]。同樣通過靜電排斥作用的超酸性融合標(biāo)簽（yjgD，rpoD，和 msyB）被發(fā)現(xiàn)能作為分子內(nèi)伴侶幫助蛋白質(zhì)正確折疊，從而提高易發(fā)生聚集的牛腸激酶，煙草腐蝕病毒蛋白酶等蛋白溶解性[9]。另一值得注意的融合標(biāo)簽是Lee等[10]報道的大腸桿菌磷酸甘油酸酯激酶的N域，融合易發(fā)生聚集的乘客蛋白后融合蛋白的溶解性增加，切除該標(biāo)簽后乘客蛋白仍然表現(xiàn)出增強的可溶性。同年，Santner等[11]報道了以本質(zhì)無序蛋白（intrinsically disordered proteins，IDPs）為基礎(chǔ)的新型提高重組蛋白可溶性表達(dá)的標(biāo)簽。由于IDPs富含極性氨基酸，使得整個融合蛋白的可溶性氨基酸比例增加，同時蛋白之間形成間隙減少蛋白質(zhì)的聚集。人工設(shè)計的具有IDPs特性的肽鏈表現(xiàn)出了比常用融合標(biāo)簽GST、MBP、NusA優(yōu)秀或是相當(dāng)?shù)奶匦?。該研究為開發(fā)設(shè)計提高重組蛋白溶解性融合標(biāo)簽提供了新方向。

表1 提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量和溶解性的融合標(biāo)簽

1 提高蛋白可溶性表達(dá)機理

蛋白質(zhì)折疊是一個復(fù)雜的過程，盡管融合標(biāo)簽技術(shù)的研究有了很大的進展，但是融合標(biāo)簽在蛋白質(zhì)折疊中的作用尚不明確[12-13]。目前對提高蛋白溶解性的機制已提出5種模型[12，14-15]，從不同的角度闡述融合標(biāo)簽在蛋白折疊中的作用。但是這些模型僅能夠解釋某些特定的融合標(biāo)簽發(fā)揮作用的機制，并不適用于所有此類標(biāo)簽[12]。這可能由于不同的融合標(biāo)簽作用方式也有所不同，如MBP一般融合在N端才會很好地發(fā)揮作用，而SET-tag融合在C端才能起作用。

（1）“electrostatic shields”模型 通過帶電載客蛋白間的靜電排斥力減少乘客蛋白分子間的聚集[8]，被稱作“electrostatic shields”。這些標(biāo)簽通常帶有很強的負(fù)電荷，如 Invitrogen公司開發(fā)的多肽標(biāo)簽 SET[8]以及一些超酸性融合標(biāo)簽（如 yjgD，rpoD，和msyB）[9，16-17]，因其富含酸性氨基酸而帶有大量負(fù)電荷，增加了新生肽之間的排斥力，使得蛋白與蛋白之間空間距離增大，聚集難以發(fā)生，從而使得乘客蛋白有足夠的時間正確折疊。Su等[18]在比較一組特殊的蛋白質(zhì)融合標(biāo)簽時發(fā)現(xiàn)蛋白酸度在增加目的蛋白溶解性中起著重要作用，酸性強的融合標(biāo)簽提高蛋白溶解性的能力也更強。其實，這類標(biāo)簽直接參與了幫助蛋白質(zhì)正確折疊，也相當(dāng)于具有一定的分子伴侶作用。

（2）“micelle”模型 融合蛋白因在細(xì)胞內(nèi)形成以不完全折疊的以疏水性乘客蛋白為中心，親水性載客蛋白包裹在外的微囊體（micelle）而表現(xiàn)為可溶性蛋白。親水性載體蛋白保護疏水性乘客蛋白與溶劑接觸，防止乘客蛋白的聚集，但是在切除標(biāo)簽后疏水性乘客蛋白是否能夠正確折疊而具有活性是未知的。研究表明，人體乳頭瘤病毒E6融合MBP表達(dá)形成了此類微囊體而以可溶性蛋白的形式表達(dá)[19]，但是乘客蛋白人體乳頭瘤病毒 E6并沒有活性。

（3）“entropic-anchor”模型 載客蛋白作為一個錨定蛋白“entropic-anchor”，限制緩慢折疊的乘客蛋白運動，減少乘客蛋白的聚集，使乘客蛋白在適宜的熵環(huán)境下折疊[20]。根據(jù)此模型解釋，融合在蛋白N端或C端所產(chǎn)生的熵作用應(yīng)當(dāng)相近因此提高蛋白可溶性表達(dá)作用也相近，然而，融合在蛋白的不同末端的作用效果往往有很大差異。因此，這種模型并不能很好的解釋提高蛋白可溶性表達(dá)的機理。

（4）“chaperone magnet”模型 載客蛋白通過與分子伴侶相互作用，引導(dǎo)分子伴侶幫助乘客蛋白折疊，這種類似于磁體作用的融合標(biāo)簽被稱作“chaperone magnet”。鐵蛋白重鏈（FTN-H）含有特殊的序列能被分子伴侶DnaK識別并結(jié)合，從而引導(dǎo)DnaK幫助乘客蛋白折疊[21]。

（5）“Chaperone-like”模型 融合標(biāo)簽本身作為一種分子伴侶，與乘客蛋白作用。據(jù)報道麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）是一種分子伴侶型融合標(biāo)簽[14]。由圖1所示，新生的融合蛋白其載客蛋白MBP已折疊而乘客蛋白未折疊，此時它有兩種不同的去向，如果乘客蛋白形成天然構(gòu)象，就產(chǎn)生可溶性的融合蛋白；或者，乘客蛋白不完全折疊自我聚集形成不溶性包涵體。折疊中間態(tài)去向在很大程度上取決于細(xì)胞內(nèi)濃度，高濃度容易產(chǎn)生聚集形成包涵體；而單分子折疊通常發(fā)生在低濃度條件下。麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）結(jié)合乘客蛋白形成隔離折疊中間態(tài)，通過折疊中間態(tài)和隔離折疊中間態(tài)的動態(tài)平衡調(diào)整細(xì)胞內(nèi)濃度，阻止蛋白分子的聚合。據(jù)報道 Trx等[7，13，22]也是作為分子伴侶幫助蛋白質(zhì)正確折疊從而提高蛋白質(zhì)的溶解性，目前研究表明此類作用機制的標(biāo)簽?zāi)軌蜉^好地促進蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)[5-6]。

圖1 MBP促進乘客蛋白正確折疊機制[14]

另外，mRNA的二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的翻譯起始在蛋白質(zhì)表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用，mRNA形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使得核糖體無法結(jié)合到對應(yīng)的 SD序列，從而減緩翻譯起始速率。同時核糖體結(jié)合位點附近的 mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性使得蛋白質(zhì)的表達(dá)量有很大差異[23]。融合標(biāo)簽通常是可溶性表達(dá)量較高的蛋白質(zhì)或是多肽，核糖體能有效的結(jié)合其mRNA，因此重組蛋白N端加上融合標(biāo)簽有利于改變mRNA的二級結(jié)構(gòu)使得核糖體能夠高效結(jié)合，從而提高重組可溶性蛋白的產(chǎn)量。研究表明大多N端標(biāo)簽?zāi)茉黾又亟M蛋白的產(chǎn)量（見表1）。另一方面，N和C末端影響蛋白質(zhì)的降解[24]，融合標(biāo)簽也可以通過減少蛋白質(zhì)降解而增加產(chǎn)量。

2 組合標(biāo)簽技術(shù)

單個融合標(biāo)簽很難滿足大規(guī)模生產(chǎn)可溶性蛋白質(zhì)過程中多方面的要求，組合標(biāo)簽?zāi)苁谷诤蠘?biāo)簽技術(shù)發(fā)揮最大作用。組合純化標(biāo)簽的使用極大地方便了許多沒有親和吸附能力或是親和力較弱的增溶性標(biāo)簽（如TrxA，NusA，MBP）的純化[25]；融合蛋白包含抗原表位或是綠色熒光蛋白串聯(lián)純化標(biāo)簽His-tag常被用于評估重組蛋白的表達(dá)情況[26]。大分子晶體學(xué)實驗室（NCI Frederick）[27]，伯克利的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)中心[28]和真核生物結(jié)構(gòu)基因組學(xué)中心常組合His-tag和MBP融合表達(dá)生產(chǎn)蛋白質(zhì)。MBP提高重組蛋白的產(chǎn)量和溶解性，His-tag則方便純化，融合蛋白通過兩次固定化金屬離子親和層析純化（IMAC）和帶組氨酸標(biāo)簽的煙草蝕紋病毒蛋白酶（His6-TEV）酶切，最終得到高純度的目的蛋白。這個系統(tǒng)避免了切除標(biāo)簽所使用的蛋白酶的污染（見圖2）。

串聯(lián)親和純化（TAP）是 1999年 Rigaut和Seraphin[29]開發(fā)了新型純化系統(tǒng)，經(jīng)過兩步連續(xù)的親和純化得到更接近自然狀態(tài)的蛋白復(fù)合物。TAP包含2個親和標(biāo)簽，鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）和蛋白A的IgG結(jié)合域（ProtA），中間由1個煙草蝕紋病毒（TEV）蛋白酶切位點連接。將目標(biāo)蛋白與CBP端相連在細(xì)胞內(nèi)融合表達(dá)在生理條件下目標(biāo)蛋白和內(nèi)源性與其相互作用的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體。首先使用免疫球蛋白 G（IgG）親和柱分離純化蛋白復(fù)合體，采用TEV蛋白酶切割標(biāo)簽獲得含有CBP的目標(biāo)蛋白復(fù)合體；再使用偶聯(lián)鈣調(diào)蛋白的親和柱結(jié)合 CBP標(biāo)簽在過量螯合劑作用下純化得到復(fù)合體進一步分析鑒定。TAP方法首先在酵母細(xì)胞中獲得成功后迅速被應(yīng)用到其他細(xì)胞和組織中。除了最早使用的 CBP-TEV-ProtA目前應(yīng)用的串聯(lián)親和純化標(biāo)簽還有S3S（串聯(lián)S-tag和Strep-tagⅡ）和PTP（串聯(lián)ProtC-TEV-ProtA）等[30]。

3 標(biāo)簽的去除

圖2 使用融合標(biāo)簽His6-MBP表達(dá)蛋白的純化原理圖

表2 重組蛋白表達(dá)和純化常用酶切位點和蛋白酶

融合標(biāo)簽可能會使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上產(chǎn)生某種不可預(yù)知的變化，因此，切除標(biāo)簽對保證蛋白質(zhì)的性質(zhì)是必要的。常用的蛋白酶有腸激酶、煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEV）、SUMO蛋白酶、凝血酶等（如表 2）。蛋白酶的位點專一性不同，有些蛋白酶位點專一性高，而有些蛋白酶可能發(fā)生非特異性切割，酶切效率通常可以通過使用更多的酶或更長的時間或在蛋白酶識別位點添加多個丙氨酸來改進。一些高位點專一性的蛋白酶，如TEV和人鼻病毒蛋白酶（PreScission）很大程度上減輕非特異性問題。但是通常目的蛋白上會留下幾個氨基酸殘基。許多蛋白質(zhì)要獲得生物活性以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性都需要特定的N端氨基酸，尤其是很多用于結(jié)構(gòu)研究以及醫(yī)療用途的蛋白質(zhì)。TEV的酶切位點左邊的甘氨酸可以換成其他氨基酸，但是會導(dǎo)致切割效率下降。Xa因子（IEGR/）和腸激酶（DDDDK/）酶切能夠形成蛋白質(zhì)天然的N端結(jié)構(gòu)，但是偶爾會在其他位置酶切[31-32]。在正確識別酶切位點的前提下，如何避免產(chǎn)生非天然N端氨基酸是很多蛋白酶使用過程中所面臨的一個挑戰(zhàn)。比起去除N端融合標(biāo)簽，C端標(biāo)簽問題更多。用來切除融合蛋白的所有蛋白酶的識別位點都在易于斷開鍵的左邊，因此切除C端標(biāo)簽后，仍會留下4～6個氨基酸殘基。某些情況下，可以使用羧肽酶消化C端的短標(biāo)簽，但羧肽酶的序列專一性還有待進一步改進。Chong等[33]使用不需要蛋白酶參與的內(nèi)含肽系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，在有二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇或半胱氨酸存在的條件下，能利用其可誘導(dǎo)的自切割活性將靶蛋白質(zhì)從融合標(biāo)簽上切除，切除后形成的蛋白質(zhì)不帶有任何額外的非天然殘基。另外還有泛素修飾蛋白質(zhì)（SUMO）以及泛素融合系統(tǒng)（Ub）利用蛋白酶識別三級結(jié)構(gòu)切割得到天然結(jié)構(gòu)的蛋白。

4 結(jié)論與展望

融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展為可溶性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)包括一些難以表達(dá)的蛋白藥物表達(dá)提供了便利，許多融合標(biāo)簽系統(tǒng)已作為實現(xiàn)可溶性表達(dá)和純化的常用方法。盡管如此，融合標(biāo)簽的應(yīng)用尚存在問題：①許多提高蛋白溶解性的融合標(biāo)簽只適用于某些蛋白，對于不同的蛋白，提高溶解性的能力也不同，目前很難準(zhǔn)確地預(yù)測融合標(biāo)簽對某一易聚集的目的蛋白的作用，只有通過大量比較實驗而選擇，工作量較大；②許多融合標(biāo)簽功能單一，很難滿足蛋白質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)中多種需求；③融合標(biāo)簽增加可溶性表達(dá)的機理尚未完全了解，很難有目的性地開發(fā)，改造和選用融合標(biāo)簽?？梢灶A(yù)見，在解決了以上 3個關(guān)鍵問題的基礎(chǔ)上，人們將得到高效多功能的融合標(biāo)簽滿足蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)和純化等多方面要求。這將為可溶性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，特別是合成生物學(xué)的發(fā)展提供強大的支撐作用。因此開發(fā)高效的多功能融合標(biāo)簽，探究融合標(biāo)簽機理以及融合標(biāo)簽技術(shù)的改進已是迫在眉睫。作者實驗室致力于開發(fā)新型的多功能融合標(biāo)簽，目前研究表明該標(biāo)簽具有提高蛋白可溶性表達(dá)的作用，并正對其純化方法和作用機理進一步研究。

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