苗 華，張 旭

(西北大學(xué)體育部，陜西西安 710069)

高脂血癥是指各種原因?qū)е碌难獫{中膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)和(或)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)過高和(或)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)過低的一種全身脂代謝異常[1]。高脂血癥是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，防治高脂血癥是預(yù)防心腦血管疾病的有效措施，因而關(guān)于高脂血癥發(fā)病機(jī)制和抗高脂血癥藥物的研究日益受到重視。代謝組學(xué)(Metabonomics或Metabolomics)是研究生物體受到刺激或擾動(dòng)(如基因修飾、環(huán)境變化等)前后代謝產(chǎn)物圖譜及其動(dòng)態(tài)變化的一種技術(shù)[2]，可以幫助尋找疾病發(fā)展過程或治療性干預(yù)的生物標(biāo)示物[3]。近年來，代謝組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物療效與藥物作用機(jī)理、毒理學(xué)與安全性評(píng)價(jià)等研究方面。代謝組學(xué)技術(shù)在中藥黃連素、銀杏葉提取物、復(fù)方血府逐瘀湯等防治高脂血癥的應(yīng)用取得了一定的進(jìn)展[4－7]。中藥澤瀉是多年水生或沼生草本植物。澤瀉性寒，味甘、淡，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱通淋、化濁降脂等功效，可用于小便不利、熱淋澀痛、水腫脹滿等癥，近代藥理證明澤瀉具有利尿、抑制動(dòng)脈粥樣硬化和抗腎結(jié)石的活性，同時(shí)還有解痙、保肝、抗炎、降低血壓以及抗高血脂等作用[8]。本研究利用高脂血癥大鼠為對(duì)象，基于UPLC-代謝組學(xué)技術(shù)和預(yù)防性給樣法，探討澤瀉提取物聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的干預(yù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1 澤瀉提取物(AR)

取3kg澤瀉，粉碎，用稀乙醇加熱回流提取，合并提取液，回收乙醇并濃縮至適量，加在已處理好的大孔吸附樹脂柱上，依次用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集相應(yīng)的洗脫液，回收乙醇，噴霧干燥，或回收乙醇，濃縮成稠膏，真空干燥，粉碎，即得。

1.2 高脂血模型－預(yù)防性給樣法

健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分成5組(8只/組)，A組(正常對(duì)照組)正常食料喂養(yǎng);B組(高脂血癥模型組)高脂飼料喂養(yǎng);C組(高脂血癥+AR組)高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)灌胃AR提取物10g生藥/kg·d;D組(高脂血癥+有氧運(yùn)動(dòng)組)高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練;E組(高脂血癥+有氧運(yùn)動(dòng)+AR組)高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)灌胃AR 10g生藥/kg·d，同時(shí)進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為4周。

1.3 生化指標(biāo)測(cè)定

第4周末大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心10 min，得上層血清。采用自動(dòng)生化儀測(cè)定TC，TG，HDL-C及LDL-C等指標(biāo);采用試劑盒測(cè)定血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)測(cè)定。

1.4 代謝組學(xué)測(cè)定

美國Waters液相色譜儀;美國XevoTM飛行時(shí)間質(zhì)譜;MassLynx V4.1工作站;Acquity UPLC HSS T3 column(2.1 mm ×100 mm，1.8 μm)色譜柱;流動(dòng)相為0.1%的甲酸乙腈(A)－0.1%的甲酸水溶液(B);梯度洗脫程序:0～0.5 min，1%B;0.5～3.0 min，1% ～30%B;3.0～7.0 min，30%～99%B;7.0 ～8.0 min，99%B;8.0 ～10.0 min，99.0% ～1.0%B;流速為0.45 mL/min;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4℃;進(jìn)樣量為2 μL。質(zhì)譜條件:ESI正離子模式;毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為3.5 kV和30 V;干燥氣流速800 L/h;干燥氣溫度450℃。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用x±SD表示，兩組間差異比較，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性;P＜0.01存在非常顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 基于UPLC-代謝組學(xué)技術(shù)的藥效學(xué)評(píng)價(jià)

為了能夠更加清晰地識(shí)別不同時(shí)間段藥效學(xué)細(xì)微變化，通常采用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法，基于UP-LC-代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法(PLS-DA)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)大批量的血清、尿液等數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，通過數(shù)據(jù)分類與特殊離群點(diǎn)的尋找等過程，就可以輕松地發(fā)現(xiàn)不同組是否有差別。第4周采用PLS-DA處理不同組間比較的結(jié)果，可以觀察到單一AR治療組介于正常組和模型組之間，但更接近與模型組(圖1A);單一有氧運(yùn)動(dòng)組幾乎與模型組沒有差別(圖1B);AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組介于正常對(duì)照組和高血脂模型組中間(圖1C)。這些結(jié)果說明不僅AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組對(duì)高脂血癥有一定的治療作用，而且二者結(jié)合的治療效果優(yōu)于單一AR組或有氧運(yùn)動(dòng)組。

圖1 第4周大鼠高脂血癥模+AR組(A)、高脂血癥模+有氧運(yùn)動(dòng)組(B)及高脂血癥模+有氧運(yùn)動(dòng)+AR組血清組(C)均值PLS-DA分析Fig.1 PLS-DA analysis of hyperlipidemia serum from AR(A)，aerobic exercise(B)and AR in combination with aerobic exercise(C)groups in the fourth week

2.2 樣品對(duì)大鼠血清TC，TG，LDL-C和HDLC的影響

與正常對(duì)照組對(duì)比，高脂血癥模型組的TC，TG和LDL-C都有較大的升高且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表1)。與模型組對(duì)比，AR組、有氧運(yùn)動(dòng)組和AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組均能顯著降低TC且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異;AR組和AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組均能顯著降低TG和LDL-C，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。與正常對(duì)照組相比，高脂血癥模型組的HDL-C都有顯著的降低，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性差異;AR組和AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組均能顯著升高HDL-C，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，其升高HDL-C的效果以AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組的效果最為顯著(見表1)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，AR，AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)可有效抑制高脂飲食大鼠血清TC，TG和LDL-C水平的升高，但沒有顯著影響HDL-C水平，聯(lián)合作用的效果優(yōu)于AR單一作用，這些與代謝組學(xué)的結(jié)果一致。

表1 不同治療組對(duì)大鼠血清TC，TG，LDL-C和HDL-C的影響Tab.2 Changes of TC，TG，LDL-C and HDL-C in the different groups

2.3 樣品對(duì)大鼠血清 SOD，GSH-Px，CAT和MDA的影響

與對(duì)照組相比，高脂模型組的SOD，GSH-Px和CAT的含量降低且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，AR組和AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組與高脂血癥模型組比升高SOD和GSH-Px的含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異;對(duì)于CAT，僅AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組升高CAT的含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異;有氧運(yùn)動(dòng)組有升高SOD，GSH-Px和CAT的含量的趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。模型組的血清MDA含量顯著升高，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的非常顯著性差異，AR組和AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組與高脂血癥模型組比降低MDA的含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(見表2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明AR，AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)可有效抑制高脂飲食大鼠血清SOD，GSH-Px和CAT的含量降低和MDA的含量增加，聯(lián)合作用的效果優(yōu)于AR單一作用，這些與代謝組學(xué)的結(jié)果一致。

表2 不同治療組對(duì)大鼠血清SOD，GSH-Px，CAT和MDA的影響Tab.2 Changes of SOD，GSH-Px，CAT and MDA in the different groups

3 討論

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后系統(tǒng)生物學(xué)的又一重要分支，代謝組學(xué)覆蓋了疾病診斷、藥物作用機(jī)制、毒理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、微生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)及植物學(xué)等方面。代謝組學(xué)的出現(xiàn)為中藥療效評(píng)價(jià)提供了全新的思路和工具，中藥(尤其是復(fù)方)的整體性作用機(jī)制和療效在系統(tǒng)代謝組學(xué)的研究方法下將可能得到充分的展示和挖掘。病理過程中代謝網(wǎng)絡(luò)的某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)紊亂，該過程使生物代謝網(wǎng)絡(luò)、使細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性產(chǎn)物的種類、濃度、相對(duì)比例發(fā)生擾動(dòng)，這種擾動(dòng)體現(xiàn)在小分子代謝產(chǎn)物集合輪廓的改變。因此，通過比較正常組與模型組的代謝產(chǎn)物集合輪廓，可以從中得出兩者內(nèi)源性產(chǎn)物種類、濃度、相對(duì)比例是否處于相同范圍，進(jìn)而推斷造模是否成功;通過比較正常組、模型組和治療組的代謝產(chǎn)物集合輪廓，可以從中得出3者內(nèi)源性產(chǎn)物變化趨勢(shì)，進(jìn)而推斷藥物對(duì)模型的治療是否有效、對(duì)模型組的治療程度、治療組與正常組的接近程度等相關(guān)的變化。PLS-DA圖顯示高脂飲食大鼠血清代謝紊亂，這與用高脂食物喂養(yǎng)大鼠，大鼠TC，TG等升高，顯示高脂血癥癥狀一致。代謝組學(xué)已成為判斷藥理模型和藥物藥效是進(jìn)展程度的新方法，代謝組學(xué)的圖譜反映了不同治療組治療高脂血癥的變化過程和改變的趨勢(shì)，代謝組學(xué)結(jié)果說明不僅AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)組對(duì)高脂血癥有一定的治療作用，而且二者結(jié)合的治療效果優(yōu)于單一AR組或有氧運(yùn)動(dòng)組。

研究報(bào)道了澤瀉提取物對(duì)高脂血癥有較好的預(yù)防和改善作用[9－12]。澤瀉能明顯降低血清中的TC，TG和LDL-C，升高血清HDL-C水平，明顯抑制主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊的生成，預(yù)先給藥則顯示有預(yù)防作用[9]。澤瀉水提醇沉物具有明顯的降血糖和降血脂作用，并能保護(hù)胰島組織免受損傷，澤瀉水提醇沉物降低血糖作用與促進(jìn)胰島素的釋放有關(guān)[10]。另外，澤瀉提取物也有抗血小板凝集、抗血栓形成及增強(qiáng)纖溶酶活性等作用，能從降低血脂、抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗血栓等多方面抑制或減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。澤瀉的乙酸乙酯提取物、乙醇浸膏的乙酸乙酯提取物等，對(duì)實(shí)驗(yàn)性高膽固醇血癥家兔和大鼠都有降血脂作用。乙酸乙酯提取物和其不溶于醋酸中的殘留部分作用最強(qiáng)。醋酸乙酯提取物每日口服1g/kg，對(duì)飼以普通飼料的正常大鼠亦有明顯的降低膽固醇作用。用同位標(biāo)記法證明。澤瀉醇A有抑制小鼠小腸酯化膽固醇的能力，并可使膽固醇在大鼠小腸內(nèi)的吸收率降低34%，但不影響亞油酸的吸收[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) AR可以降低血清 TG，TC，LDL-C，升高血清HDL-C含量，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。本研究顯示AR和AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)能增加血清SOD，GSH-Px和CAT含量，同時(shí)下調(diào)血清MDA含量，AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)比單一的AR或有氧運(yùn)動(dòng)更好地改善機(jī)體的脂代謝紊亂。藥物與有氧運(yùn)動(dòng)的結(jié)合可能是治療高脂血癥的一條有效途徑。

4 結(jié)論

AR或AR結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)都可以有效地改善機(jī)體的脂代謝紊亂，降低血清中的TC，TG，LDL-C含量。聯(lián)合作用的效果優(yōu)于單一AR或有氧運(yùn)動(dòng)作用;AR配合有氧運(yùn)動(dòng)改善脂代謝紊亂的機(jī)制可能與抑制血脂異常、增加血清 SOD，GSH-Px，CAT，降低血清MDA等物質(zhì)含量和活性有關(guān)。

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