王 霞 丁繼峰 鹿保鑫 張東杰

(黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院1，大慶 163319)(黑龍江省雙鴨山市友誼縣食品藥品監(jiān)督管理局2，雙鴨山 155800)

蛋白質(zhì)是人體維持正常生命活動最基本的物質(zhì)，人體每天必須從食物中攝取一定量的蛋白質(zhì)，補充必需氨基酸的攝入量，從而維持人體的正常生活和生命需要[1-3]。玉米胚芽含有豐富的脂肪和蛋白資源，其中胚芽蛋白具有良好的功能性質(zhì)，可以作為食品添加劑添加到食物當中從而改善食物的感官和組織特性，提高產(chǎn)品品質(zhì)，提高營養(yǎng)價值，玉米胚芽中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)在20%左右，主要為白蛋白和球蛋白，且玉米胚芽蛋白中富含多種人體必需氨基酸，其中賴氨酸和色氨酸含量相對較高，特別是賴氨酸高達5.8%左右[4-5]。本研究首先采用超臨界CO2萃取方法制備脫脂玉米胚芽粉，利用酶法和堿溶酸沉法[6-11]相結合的提取玉米胚芽粉中的蛋白。探討酶添加量、提取溫度和pH等因素對玉米胚芽蛋白提取率的影響，對試驗條件進行了優(yōu)化組合，對提取物中氨基酸組成進行了測定。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

脫脂玉米胚芽粉：自制。α-淀粉酶：北京奧得星生物技術有限公司；氫氧化鈉：南京化學試劑有限公司；鹽酸：南京化學試劑有限公司；SDS(十二烷基磺酸鈉)：北京康倍斯科技有限公司；Acr(丙烯酰胺)：北京康倍斯科技有限公司；甘氨酸：天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；溴酚藍：天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；考馬斯亮藍R250：上?；瘜W試劑有限公司等；以上均為分析純。

1.2 主要儀器

HA121-50-01超臨界流體萃取裝置：南通市華安超臨界萃取有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；F-160粉碎機：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；DELTA 320 型酸度計：梅特勒—托制多儀器(上海)有限公司；SPD50自動定氮儀：北京三品科技儀器有限公司；L-8800全自動氨基酸分析儀：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米胚芽蛋白提取的工藝流程

玉米胚芽→脫除脂肪→玉米胚芽蛋白提取液→調(diào)節(jié)pH 9.0→加溫攪拌→3次離心→提取上清液→調(diào)pH 6.3加α-淀粉酶→65 ℃酶解→調(diào)pH→2次離心→沉淀脫鹽→蛋白含量測定

1.3.2 單因素試驗設計

選擇對玉米胚芽蛋白提取效果有影響的4個主要因素：α-淀粉酶添加量X1，提取溫度X2，酶解時間X3，酸沉pHX4，以蛋白提取率為考核標準，進行單因素試驗。

1.3.3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計試驗

在單因素試驗的基礎上，確定中心組合因素(α-淀粉酶添加量、提取溫度、酶解時間、提取pH)與水平。以玉米胚芽蛋白提取率為響應值，通過二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗對提取條件進行優(yōu)化。變量參數(shù)P=4；星號臂值R=2；±1水平的因素點試驗全部實施為Mc=2P=16；±R水平的星號臂點為MR=2P=8；為了使得二次旋轉(zhuǎn)組合設計具有正交性，各因素是零水平的中心為M0=12；總試驗點N=MC+MR+M0=36。

1.3.4 玉米胚芽蛋白提取率的測定

玉米胚芽提取率=

1.3.5 玉米胚芽蛋白的電泳檢測

采用垂直板電泳，根據(jù)表1濃縮膠分離膠配方依次灌膠，制備樣品，混勻冷卻后上樣，在90 V恒流條件下1 h，后100 V恒流條件下電泳3 h。電泳完畢后染色、脫色直至背景清晰為止。

1.3.6 玉米胚芽蛋白的氨基酸組分測定

大多數(shù)氨基酸與茚三酮衍生物呈藍紫色，在570 nm處有最大吸收；脯氨酸與茚三酮衍生物呈黃色，在440 nm處有最大吸收，根據(jù)這一特點，采用氨基酸全自動分析儀，進行玉米胚芽蛋白的氨基酸組分測定。

2 結果與討論

2.1 玉米胚芽蛋白提取單因素試驗結果

2.1.1 α-淀粉酶添加量對玉米胚芽蛋白提取率的影響

圖1中的試驗條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10，提取溫度為65 ℃，酸沉pH為4.0，酶解時間2 h，α-淀粉酶添加量分別在0.1%、0.2%、0.3%、0.4%進行研究，從圖1可以看出，α-淀粉酶的添加量在0.1%～0.3%之間時，隨著α-淀粉酶添加量的增加玉米胚芽蛋白提取率而顯著增加，在添加量為0.3%時，提取率達到最高值62.81%。繼續(xù)增加α-淀粉酶添加量時，蛋白提取率有所下降。因此選取α-淀粉酶的最適添加量為0.3%。

圖1 α-淀粉酶添加量對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.1.2 提取溫度對玉米胚芽蛋白提取率的影響

圖2中的試驗條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10，α-淀粉酶添加量為0.3%，酸沉pH為4.0，酶解時間2 h，提取溫度分別25～75 ℃進行試驗以測定玉米胚芽蛋白的提取率，其中提取溫度在25～65 ℃之間時，玉米胚芽蛋白提取率隨著提取溫度的上升而顯著增加，在溫度為65 ℃時，蛋白提取率達到最大為61.74%。繼續(xù)升高時，蛋白提取率有所下降，可能是因為過高的溫度使蛋白的結構發(fā)生改變甚至變性所致。根據(jù)溫度對玉米胚芽蛋白提取率的影響關系曲線選取最適提取溫度為65 ℃。

圖2 提取溫度對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.1.3 酶解時間對玉米胚芽蛋白提取率的影響

圖3的試驗條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10，提取溫度為65 ℃，在α-淀粉酶添加量為0.3%，酸沉pH為4.0，酶解時間分別為0.5～2.5 h條件下進行試驗，隨著酶解時間延長，玉米胚芽蛋白提取率逐漸增加，在2 h以后達到平衡，繼續(xù)延長酶解時間對蛋白提取率的提高影響不大。根據(jù)酶解時間對玉米胚芽蛋白提取率的影響關系曲線選取最適酶解時間2 h。

圖3 酶解時間對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.1.4 PH對玉米胚芽蛋白提取率的影響

圖4中試驗條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10，提取溫度為65 ℃，在α-淀粉酶添加量為0.3%，酶解時間為2h，酸沉pH為3.0～5.0，進行試驗，在pH在4.0時，蛋白提取率達到最大為61.99%。pH在小于或者大于4.0時，蛋白提取率較低，說明玉米胚芽蛋白的等電點在4.0左右，偏離等電點時，一部分蛋白重新被溶解，蛋白含量有所降低。因此選擇pH為4.0做為二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗的最優(yōu)水平。

圖4 pH對玉米胚芽蛋白提取率的影響

2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計試驗結果

2.2.1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗結果

二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗設計及結果見表1、表2。

表1 試驗因素水平編碼表

表2 試驗設計及結果

表2(續(xù))

回歸方程的方差分析及F檢驗和t檢驗結果分別見表3、表4和表5。

表3 F檢驗分析表

表4 回歸方程各項的方差分析表

表5 t檢驗方差分析表

對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，以玉米胚芽蛋白提取率作為衡量指標即Y值，得到以4種影響因素的編碼值為自變量的回歸方程如下：

Y=-390.655 764+124.684 945X1+9.891 081X2+27.151 451X3+46.218 900X4-151.078 556X12+1.270 573X1X2-0.091 431X22-23.998 524X1X3+0.112 030X2X3-9.704 570X32-14.894 267X1X4+0.262 115X2X4+3.640 295X3X4-8.243 142X42

回歸方程顯著性分析結果：F1=38.57>F0.01=3.03，說明差異極顯著。失擬性檢驗F2=2.27

2.2.1.1主效應分析

4種因素對玉米胚芽蛋白提取率的影響程度見表6，由表可以得出4種因素對玉米胚芽蛋白提取率的影響順序為：X2>X3>X1>X4，即提取溫度對玉米胚芽蛋白提取率影響最大，酶解時間次之，再次為α-淀粉酶添加量，pH對其影響最小。

表6 關鍵因子重要性分析

2.2.1.2 模擬尋優(yōu)及驗證

對回歸方程進行計算機模擬尋優(yōu)，結果見表7，得到玉米胚芽蛋白的最佳提取條件為：α-淀粉酶添加量0.31%，提取溫度63.29 ℃，酶解時間2.12 h，pH 3.99，理論蛋白提取率為63.12%。根據(jù)實際操作情況，α-淀粉酶添加量0.3%，提取溫度63 ℃，酶解時間2 h，pH4.0，為條件進行驗證，實際蛋白提取率為61.86%，誤差為2%≤5%，說明優(yōu)化模型擬合較好。

表7 試驗結果

注：3次測定值分別為61.79%、61.86%、61.92%的平均值。

2.2.2 玉米胚芽蛋白電泳檢測結果

對所提取的玉米胚芽蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測結果如圖5所示，根據(jù)標準蛋白所作的半對數(shù)標準曲線，接合各蛋白遷移率Rf值，可算出玉米胚芽蛋白的分子質(zhì)量為94.5、72.3、55.8、30.2 ku，說明提取的玉米胚芽蛋白并不是單一蛋白。

圖5 蛋白電泳圖

2.2.3 玉米胚芽蛋白的氨基酸組成測定結果

在酸性條件下，經(jīng)氨基酸全自動分析儀檢測，玉米胚芽蛋白中含有7種人體必需氨基酸，見圖6和表8。

圖6 氨基酸色譜分離圖

表8 人體所需8種氨基酸與玉胚芽蛋白所含氨基酸對照表

注：+表示含有該種氨基酸，—表示不含該種氨基酸。

3 結論

玉米胚芽經(jīng)過超臨界CO2萃取脫脂后進行蛋白提取試驗，在提取過程中添加α-淀粉酶，通過單因素試驗考察了α-淀粉酶添加量、提取溫度、酶解時間以及酸沉pH 4個因素對提取玉米胚芽蛋白提取率的影響，并在此單因素試驗基礎上進行四元二次旋轉(zhuǎn)回歸組合試驗對提取條件進行優(yōu)化，玉米胚芽蛋白的最佳提取條件為：α-淀粉酶添加量0.3%，提取溫度63 ℃，酶解時間2 h，pH4.0，所制得玉米胚芽蛋白產(chǎn)品提取率為61.86%。經(jīng)過電泳檢測可計算出玉米胚芽蛋白的分子質(zhì)量為94.5、72.3、55.8、30.2 ku，說明提取的玉米胚芽蛋白并不是單一蛋白。在酸性條件下，經(jīng)氨基酸全自動分析儀測定，玉米胚芽蛋白中含有7種人體必需氨基酸：蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸。

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