王勝啟　馬艷艷　李靜等

[摘要] 目的 評(píng)價(jià)LAMP在食品衛(wèi)生沙門(mén)菌屬檢驗(yàn)中的應(yīng)用效果。 方法 選擇145份食品標(biāo)本，采用LAMP方法和分離培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率。 結(jié)果 LAMP陽(yáng)性率為12.4%，分離培養(yǎng)法陽(yáng)性率為6.2%。兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。兩種方法的陽(yáng)性符合率為77.8%，陰性符合率為91.9%。 結(jié)論LAMP法用于食品衛(wèi)生沙門(mén)菌屬的檢驗(yàn)，具有快速、方便、陽(yáng)性率高等優(yōu)點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 沙門(mén)菌屬；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；分離培養(yǎng)；食品衛(wèi)生檢驗(yàn)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R155.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）12-0114-02

[Abstract] Objective To evaluate application of salmonella LAMP in sanitary inspection of foodstuffs. Methods Selected 145 food samples were detected by LAMP and separated cultivation method. Positive rate was compared. Results Positive rate of LAMP was 12.4%， and that of separated cultivation method was 6.2%. There was significant difference （P < 0.05）. Positive coincidence rate of two methods was 77.8%， and negative coincidence rate was 91.9%. Conclusion Salmonella LAMP for sanitary inspection of foodstuffs shows rapid， convenience， high positive rate.

[Key words] Salmonella； LAMP； Sanitary inspection of foodstuffs

在世界各國(guó)的種類(lèi)細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)菌引起的食物中毒常列榜首[1]。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的血清型有216個(gè)。傳統(tǒng)對(duì)沙門(mén)菌的檢測(cè)主要有分離培養(yǎng)方法，雖然準(zhǔn)確但是程序繁瑣，而免疫學(xué)方法的敏感度相對(duì)較低，PCR等敏感度和特異度均較高，但是設(shè)備要求較高，在基層不容易推廣應(yīng)用[2，3]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[4]。本研究比較環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)食品標(biāo)本沙門(mén)菌屬與分離培養(yǎng)法的一致性，探討其在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

2013年6～8月選擇145份食品標(biāo)本，其中冷凍生肉20份，生鮮肉20份，熟肉20份，非發(fā)酵豆制品20份，速凍米面20份，生水產(chǎn)品10份，冰激凌10份，沙拉10份，鮮榨果汁10份，生食類(lèi)蔬菜5份。陽(yáng)性控制菌株：腸炎沙門(mén)菌。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本前增菌 將收集到的標(biāo)本取25 g，裝入無(wú)菌均質(zhì)袋中，拍擊式均質(zhì)器拍打2 min，37℃培養(yǎng)10 h。冷凍食品在45℃下解凍15 min。

1.2.2 分離培養(yǎng)法 將增菌后的145份標(biāo)本取1 mL，接種于10 mL的TTB增菌液中，42℃培養(yǎng)24 h。另取1 mL，接種于10 mL的SC增菌液中，37℃培養(yǎng)24 h。分別取增菌液1環(huán)，接種于BS平板和XLD平板，37℃培養(yǎng)24 h。取可疑菌落3個(gè)，接種于TSI、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。對(duì)于生化反應(yīng)初步符合沙門(mén)菌特征的，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上取可疑菌落，生理鹽水制成菌懸液，在微生物鑒定系統(tǒng)上進(jìn)行分析。如果BS平板及XLD平板上無(wú)可疑菌落，BS平板37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，如果仍無(wú)可疑菌落則為陰性。

1.2.3 LAMP檢測(cè)方法 取標(biāo)本前增菌液1 mL，離心，10 000 r/min，2 min，棄上清，提取核酸，另取1 μL上清液，制作待檢模板DNA。引物由百壹星辰（北京）生物科技有限公司提供。檢測(cè)145份標(biāo)本DNA。反應(yīng)結(jié)束后，肉眼觀察反應(yīng)液為綠色者為陽(yáng)性，無(wú)色或者棕色者為陰性?；蛘卟捎秒娪痉椒ㄟM(jìn)行鑒定，電泳圖片顯示最小片段>100 bp的特征性梯狀為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同標(biāo)本兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果

見(jiàn)表1。LAMP陽(yáng)性率為12.4%，分離培養(yǎng)法陽(yáng)性率為6.2%。兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

沙門(mén)菌病是指由各種類(lèi)型沙門(mén)菌所引起的對(duì)人類(lèi)、家畜及野生禽獸不同形式感染的總稱(chēng)。感染沙門(mén)菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒[5，6]。細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)菌引起的食物中毒常列榜首，引起腸傷寒、腸胃炎和敗血癥，也可傳染人類(lèi)以外的其他多種動(dòng)物。沙門(mén)菌通過(guò)消化道傳染致病[7，8]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是2000年由日本榮研化學(xué)株式會(huì)社開(kāi)發(fā)的一種新的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下保溫30～60 min，完成擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。其靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴(lài)任何專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備，可以現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。袁發(fā)滸等[9]探討了腸炎沙門(mén)菌的LAMP檢測(cè)方法的建立，認(rèn)為L(zhǎng)AMP法可快速特異地檢測(cè)出腸炎沙門(mén)菌，該方法反應(yīng)靈敏度高，可用于食品中腸炎沙門(mén)菌的快速檢測(cè)。黃金海等[10]探討LAMP快速檢測(cè)方法在食品中沙門(mén)菌檢測(cè)中的應(yīng)用，結(jié)果顯示該方法僅對(duì)沙門(mén)菌產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，所建立的檢測(cè)沙門(mén)菌方法具有較高的特異性與靈敏性，操作簡(jiǎn)單、快速，可用于沙門(mén)菌污染食品的快速檢測(cè)。李雪等[11]分別采用LAMP法、PCR和國(guó)標(biāo)法對(duì)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的雞蛋蛋殼及內(nèi)容物進(jìn)行沙門(mén)菌的檢測(cè)，LAMP和PCR的沙門(mén)菌檢出率均高于國(guó)標(biāo)法，而LAMP法敏感性、特異性和符合率也均高于PCR法，因此，LAMP是一種快速、敏感和高度特異性的沙門(mén)菌檢測(cè)方法。田楨干等[12]探討了LAMP技術(shù)快速檢測(cè)沙門(mén)菌方法的建立及其應(yīng)用，沙門(mén)菌屬6種不同血清型菌株LAMP檢測(cè)都呈陽(yáng)性，其他4種腸道細(xì)菌均為陰性；LAMP法的靈敏度與RT-PCR方法接近，達(dá)103 CFU/mL，是膠體金檢測(cè)法的100～1000倍；54株沙門(mén)菌臨床分離樣本實(shí)驗(yàn)符合率達(dá)100%。

細(xì)菌分離培養(yǎng)是常用的一種檢測(cè)方法，但是其程序復(fù)雜，不能用于快速檢測(cè)，其得出陽(yáng)性結(jié)果需要7 d時(shí)間，并且細(xì)菌分離需要將兩次增菌后再分離培養(yǎng)，其生化鑒定程序繁瑣，鑒定系統(tǒng)昂貴，不利于在基層推廣[9，10]。LAMP法對(duì)前增菌液進(jìn)行核酸提取后就可以進(jìn)行擴(kuò)增，在60 min就可以完成擴(kuò)增，在24 h內(nèi)就可以檢出沙門(mén)菌屬，具有更加快捷的優(yōu)點(diǎn)。并且在結(jié)果的判定中，可以肉眼觀察，更方便和直觀。本研究將LAMP方法與細(xì)菌分離培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，對(duì)145份食品進(jìn)行沙門(mén)菌的檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率存在顯著差異，LAMP法的陽(yáng)性率顯著高于細(xì)菌分離培養(yǎng)法，而以細(xì)胞分離培養(yǎng)做參照，對(duì)兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率和陰性符合率進(jìn)行分析，顯示兩種方法的陽(yáng)性符合率為77.8%，而兩組的陰性符合率高達(dá)91.9%。

綜上所述，LAMP法用于食品衛(wèi)生沙門(mén)菌屬的檢驗(yàn)，具有快速、方便、陽(yáng)性率高等優(yōu)點(diǎn)，可以用于食品衛(wèi)生的初步檢驗(yàn)，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的可進(jìn)一步通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行菌株分離及鑒定分型。endprint

[摘要] 目的 評(píng)價(jià)LAMP在食品衛(wèi)生沙門(mén)菌屬檢驗(yàn)中的應(yīng)用效果。 方法 選擇145份食品標(biāo)本，采用LAMP方法和分離培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率。 結(jié)果 LAMP陽(yáng)性率為12.4%，分離培養(yǎng)法陽(yáng)性率為6.2%。兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。兩種方法的陽(yáng)性符合率為77.8%，陰性符合率為91.9%。 結(jié)論LAMP法用于食品衛(wèi)生沙門(mén)菌屬的檢驗(yàn)，具有快速、方便、陽(yáng)性率高等優(yōu)點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 沙門(mén)菌屬；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；分離培養(yǎng)；食品衛(wèi)生檢驗(yàn)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R155.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）12-0114-02

[Abstract] Objective To evaluate application of salmonella LAMP in sanitary inspection of foodstuffs. Methods Selected 145 food samples were detected by LAMP and separated cultivation method. Positive rate was compared. Results Positive rate of LAMP was 12.4%， and that of separated cultivation method was 6.2%. There was significant difference （P < 0.05）. Positive coincidence rate of two methods was 77.8%， and negative coincidence rate was 91.9%. Conclusion Salmonella LAMP for sanitary inspection of foodstuffs shows rapid， convenience， high positive rate.

[Key words] Salmonella； LAMP； Sanitary inspection of foodstuffs

在世界各國(guó)的種類(lèi)細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)菌引起的食物中毒常列榜首[1]。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的血清型有216個(gè)。傳統(tǒng)對(duì)沙門(mén)菌的檢測(cè)主要有分離培養(yǎng)方法，雖然準(zhǔn)確但是程序繁瑣，而免疫學(xué)方法的敏感度相對(duì)較低，PCR等敏感度和特異度均較高，但是設(shè)備要求較高，在基層不容易推廣應(yīng)用[2，3]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[4]。本研究比較環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)食品標(biāo)本沙門(mén)菌屬與分離培養(yǎng)法的一致性，探討其在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

2013年6～8月選擇145份食品標(biāo)本，其中冷凍生肉20份，生鮮肉20份，熟肉20份，非發(fā)酵豆制品20份，速凍米面20份，生水產(chǎn)品10份，冰激凌10份，沙拉10份，鮮榨果汁10份，生食類(lèi)蔬菜5份。陽(yáng)性控制菌株：腸炎沙門(mén)菌。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本前增菌 將收集到的標(biāo)本取25 g，裝入無(wú)菌均質(zhì)袋中，拍擊式均質(zhì)器拍打2 min，37℃培養(yǎng)10 h。冷凍食品在45℃下解凍15 min。

1.2.2 分離培養(yǎng)法 將增菌后的145份標(biāo)本取1 mL，接種于10 mL的TTB增菌液中，42℃培養(yǎng)24 h。另取1 mL，接種于10 mL的SC增菌液中，37℃培養(yǎng)24 h。分別取增菌液1環(huán)，接種于BS平板和XLD平板，37℃培養(yǎng)24 h。取可疑菌落3個(gè)，接種于TSI、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。對(duì)于生化反應(yīng)初步符合沙門(mén)菌特征的，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上取可疑菌落，生理鹽水制成菌懸液，在微生物鑒定系統(tǒng)上進(jìn)行分析。如果BS平板及XLD平板上無(wú)可疑菌落，BS平板37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，如果仍無(wú)可疑菌落則為陰性。

1.2.3 LAMP檢測(cè)方法 取標(biāo)本前增菌液1 mL，離心，10 000 r/min，2 min，棄上清，提取核酸，另取1 μL上清液，制作待檢模板DNA。引物由百壹星辰（北京）生物科技有限公司提供。檢測(cè)145份標(biāo)本DNA。反應(yīng)結(jié)束后，肉眼觀察反應(yīng)液為綠色者為陽(yáng)性，無(wú)色或者棕色者為陰性?；蛘卟捎秒娪痉椒ㄟM(jìn)行鑒定，電泳圖片顯示最小片段>100 bp的特征性梯狀為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同標(biāo)本兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果

見(jiàn)表1。LAMP陽(yáng)性率為12.4%，分離培養(yǎng)法陽(yáng)性率為6.2%。兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

沙門(mén)菌病是指由各種類(lèi)型沙門(mén)菌所引起的對(duì)人類(lèi)、家畜及野生禽獸不同形式感染的總稱(chēng)。感染沙門(mén)菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒[5，6]。細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)菌引起的食物中毒常列榜首，引起腸傷寒、腸胃炎和敗血癥，也可傳染人類(lèi)以外的其他多種動(dòng)物。沙門(mén)菌通過(guò)消化道傳染致病[7，8]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是2000年由日本榮研化學(xué)株式會(huì)社開(kāi)發(fā)的一種新的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下保溫30～60 min，完成擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。其靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴(lài)任何專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備，可以現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。袁發(fā)滸等[9]探討了腸炎沙門(mén)菌的LAMP檢測(cè)方法的建立，認(rèn)為L(zhǎng)AMP法可快速特異地檢測(cè)出腸炎沙門(mén)菌，該方法反應(yīng)靈敏度高，可用于食品中腸炎沙門(mén)菌的快速檢測(cè)。黃金海等[10]探討LAMP快速檢測(cè)方法在食品中沙門(mén)菌檢測(cè)中的應(yīng)用，結(jié)果顯示該方法僅對(duì)沙門(mén)菌產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，所建立的檢測(cè)沙門(mén)菌方法具有較高的特異性與靈敏性，操作簡(jiǎn)單、快速，可用于沙門(mén)菌污染食品的快速檢測(cè)。李雪等[11]分別采用LAMP法、PCR和國(guó)標(biāo)法對(duì)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的雞蛋蛋殼及內(nèi)容物進(jìn)行沙門(mén)菌的檢測(cè)，LAMP和PCR的沙門(mén)菌檢出率均高于國(guó)標(biāo)法，而LAMP法敏感性、特異性和符合率也均高于PCR法，因此，LAMP是一種快速、敏感和高度特異性的沙門(mén)菌檢測(cè)方法。田楨干等[12]探討了LAMP技術(shù)快速檢測(cè)沙門(mén)菌方法的建立及其應(yīng)用，沙門(mén)菌屬6種不同血清型菌株LAMP檢測(cè)都呈陽(yáng)性，其他4種腸道細(xì)菌均為陰性；LAMP法的靈敏度與RT-PCR方法接近，達(dá)103 CFU/mL，是膠體金檢測(cè)法的100～1000倍；54株沙門(mén)菌臨床分離樣本實(shí)驗(yàn)符合率達(dá)100%。

細(xì)菌分離培養(yǎng)是常用的一種檢測(cè)方法，但是其程序復(fù)雜，不能用于快速檢測(cè)，其得出陽(yáng)性結(jié)果需要7 d時(shí)間，并且細(xì)菌分離需要將兩次增菌后再分離培養(yǎng)，其生化鑒定程序繁瑣，鑒定系統(tǒng)昂貴，不利于在基層推廣[9，10]。LAMP法對(duì)前增菌液進(jìn)行核酸提取后就可以進(jìn)行擴(kuò)增，在60 min就可以完成擴(kuò)增，在24 h內(nèi)就可以檢出沙門(mén)菌屬，具有更加快捷的優(yōu)點(diǎn)。并且在結(jié)果的判定中，可以肉眼觀察，更方便和直觀。本研究將LAMP方法與細(xì)菌分離培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，對(duì)145份食品進(jìn)行沙門(mén)菌的檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率存在顯著差異，LAMP法的陽(yáng)性率顯著高于細(xì)菌分離培養(yǎng)法，而以細(xì)胞分離培養(yǎng)做參照，對(duì)兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率和陰性符合率進(jìn)行分析，顯示兩種方法的陽(yáng)性符合率為77.8%，而兩組的陰性符合率高達(dá)91.9%。

綜上所述，LAMP法用于食品衛(wèi)生沙門(mén)菌屬的檢驗(yàn)，具有快速、方便、陽(yáng)性率高等優(yōu)點(diǎn)，可以用于食品衛(wèi)生的初步檢驗(yàn)，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的可進(jìn)一步通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行菌株分離及鑒定分型。endprint

[摘要] 目的 評(píng)價(jià)LAMP在食品衛(wèi)生沙門(mén)菌屬檢驗(yàn)中的應(yīng)用效果。 方法 選擇145份食品標(biāo)本，采用LAMP方法和分離培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率。 結(jié)果 LAMP陽(yáng)性率為12.4%，分離培養(yǎng)法陽(yáng)性率為6.2%。兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。兩種方法的陽(yáng)性符合率為77.8%，陰性符合率為91.9%。 結(jié)論LAMP法用于食品衛(wèi)生沙門(mén)菌屬的檢驗(yàn)，具有快速、方便、陽(yáng)性率高等優(yōu)點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 沙門(mén)菌屬；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；分離培養(yǎng)；食品衛(wèi)生檢驗(yàn)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R155.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）12-0114-02

[Abstract] Objective To evaluate application of salmonella LAMP in sanitary inspection of foodstuffs. Methods Selected 145 food samples were detected by LAMP and separated cultivation method. Positive rate was compared. Results Positive rate of LAMP was 12.4%， and that of separated cultivation method was 6.2%. There was significant difference （P < 0.05）. Positive coincidence rate of two methods was 77.8%， and negative coincidence rate was 91.9%. Conclusion Salmonella LAMP for sanitary inspection of foodstuffs shows rapid， convenience， high positive rate.

[Key words] Salmonella； LAMP； Sanitary inspection of foodstuffs

在世界各國(guó)的種類(lèi)細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)菌引起的食物中毒常列榜首[1]。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的血清型有216個(gè)。傳統(tǒng)對(duì)沙門(mén)菌的檢測(cè)主要有分離培養(yǎng)方法，雖然準(zhǔn)確但是程序繁瑣，而免疫學(xué)方法的敏感度相對(duì)較低，PCR等敏感度和特異度均較高，但是設(shè)備要求較高，在基層不容易推廣應(yīng)用[2，3]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[4]。本研究比較環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)食品標(biāo)本沙門(mén)菌屬與分離培養(yǎng)法的一致性，探討其在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

2013年6～8月選擇145份食品標(biāo)本，其中冷凍生肉20份，生鮮肉20份，熟肉20份，非發(fā)酵豆制品20份，速凍米面20份，生水產(chǎn)品10份，冰激凌10份，沙拉10份，鮮榨果汁10份，生食類(lèi)蔬菜5份。陽(yáng)性控制菌株：腸炎沙門(mén)菌。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本前增菌 將收集到的標(biāo)本取25 g，裝入無(wú)菌均質(zhì)袋中，拍擊式均質(zhì)器拍打2 min，37℃培養(yǎng)10 h。冷凍食品在45℃下解凍15 min。

1.2.2 分離培養(yǎng)法 將增菌后的145份標(biāo)本取1 mL，接種于10 mL的TTB增菌液中，42℃培養(yǎng)24 h。另取1 mL，接種于10 mL的SC增菌液中，37℃培養(yǎng)24 h。分別取增菌液1環(huán)，接種于BS平板和XLD平板，37℃培養(yǎng)24 h。取可疑菌落3個(gè)，接種于TSI、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。對(duì)于生化反應(yīng)初步符合沙門(mén)菌特征的，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上取可疑菌落，生理鹽水制成菌懸液，在微生物鑒定系統(tǒng)上進(jìn)行分析。如果BS平板及XLD平板上無(wú)可疑菌落，BS平板37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，如果仍無(wú)可疑菌落則為陰性。

1.2.3 LAMP檢測(cè)方法 取標(biāo)本前增菌液1 mL，離心，10 000 r/min，2 min，棄上清，提取核酸，另取1 μL上清液，制作待檢模板DNA。引物由百壹星辰（北京）生物科技有限公司提供。檢測(cè)145份標(biāo)本DNA。反應(yīng)結(jié)束后，肉眼觀察反應(yīng)液為綠色者為陽(yáng)性，無(wú)色或者棕色者為陰性?；蛘卟捎秒娪痉椒ㄟM(jìn)行鑒定，電泳圖片顯示最小片段>100 bp的特征性梯狀為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同標(biāo)本兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果

見(jiàn)表1。LAMP陽(yáng)性率為12.4%，分離培養(yǎng)法陽(yáng)性率為6.2%。兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

沙門(mén)菌病是指由各種類(lèi)型沙門(mén)菌所引起的對(duì)人類(lèi)、家畜及野生禽獸不同形式感染的總稱(chēng)。感染沙門(mén)菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒[5，6]。細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)菌引起的食物中毒常列榜首，引起腸傷寒、腸胃炎和敗血癥，也可傳染人類(lèi)以外的其他多種動(dòng)物。沙門(mén)菌通過(guò)消化道傳染致病[7，8]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是2000年由日本榮研化學(xué)株式會(huì)社開(kāi)發(fā)的一種新的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下保溫30～60 min，完成擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。其靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴(lài)任何專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備，可以現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。袁發(fā)滸等[9]探討了腸炎沙門(mén)菌的LAMP檢測(cè)方法的建立，認(rèn)為L(zhǎng)AMP法可快速特異地檢測(cè)出腸炎沙門(mén)菌，該方法反應(yīng)靈敏度高，可用于食品中腸炎沙門(mén)菌的快速檢測(cè)。黃金海等[10]探討LAMP快速檢測(cè)方法在食品中沙門(mén)菌檢測(cè)中的應(yīng)用，結(jié)果顯示該方法僅對(duì)沙門(mén)菌產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，所建立的檢測(cè)沙門(mén)菌方法具有較高的特異性與靈敏性，操作簡(jiǎn)單、快速，可用于沙門(mén)菌污染食品的快速檢測(cè)。李雪等[11]分別采用LAMP法、PCR和國(guó)標(biāo)法對(duì)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的雞蛋蛋殼及內(nèi)容物進(jìn)行沙門(mén)菌的檢測(cè)，LAMP和PCR的沙門(mén)菌檢出率均高于國(guó)標(biāo)法，而LAMP法敏感性、特異性和符合率也均高于PCR法，因此，LAMP是一種快速、敏感和高度特異性的沙門(mén)菌檢測(cè)方法。田楨干等[12]探討了LAMP技術(shù)快速檢測(cè)沙門(mén)菌方法的建立及其應(yīng)用，沙門(mén)菌屬6種不同血清型菌株LAMP檢測(cè)都呈陽(yáng)性，其他4種腸道細(xì)菌均為陰性；LAMP法的靈敏度與RT-PCR方法接近，達(dá)103 CFU/mL，是膠體金檢測(cè)法的100～1000倍；54株沙門(mén)菌臨床分離樣本實(shí)驗(yàn)符合率達(dá)100%。

細(xì)菌分離培養(yǎng)是常用的一種檢測(cè)方法，但是其程序復(fù)雜，不能用于快速檢測(cè)，其得出陽(yáng)性結(jié)果需要7 d時(shí)間，并且細(xì)菌分離需要將兩次增菌后再分離培養(yǎng)，其生化鑒定程序繁瑣，鑒定系統(tǒng)昂貴，不利于在基層推廣[9，10]。LAMP法對(duì)前增菌液進(jìn)行核酸提取后就可以進(jìn)行擴(kuò)增，在60 min就可以完成擴(kuò)增，在24 h內(nèi)就可以檢出沙門(mén)菌屬，具有更加快捷的優(yōu)點(diǎn)。并且在結(jié)果的判定中，可以肉眼觀察，更方便和直觀。本研究將LAMP方法與細(xì)菌分離培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，對(duì)145份食品進(jìn)行沙門(mén)菌的檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率存在顯著差異，LAMP法的陽(yáng)性率顯著高于細(xì)菌分離培養(yǎng)法，而以細(xì)胞分離培養(yǎng)做參照，對(duì)兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率和陰性符合率進(jìn)行分析，顯示兩種方法的陽(yáng)性符合率為77.8%，而兩組的陰性符合率高達(dá)91.9%。

綜上所述，LAMP法用于食品衛(wèi)生沙門(mén)菌屬的檢驗(yàn)，具有快速、方便、陽(yáng)性率高等優(yōu)點(diǎn)，可以用于食品衛(wèi)生的初步檢驗(yàn)，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的可進(jìn)一步通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行菌株分離及鑒定分型。endprint