張連富，徐善水，方興根，李子付，江國權(quán)

兔梭形動脈瘤模型的制作

張連富，徐善水，方興根，李子付，江國權(quán)

目的利用豬胰彈力酶誘導(dǎo)法制作類似人顱內(nèi)動脈瘤特點的兔頸內(nèi)動脈梭形動脈瘤模型。方法采用新西蘭大白兔25只，隨機分為正常對照組5只、0.9%氯化鈉溶液對照組5只和實驗組15只，實驗組再隨機分為3亞組（7、14和21 d組），每組5只。應(yīng)用豬胰彈性蛋白酶消化兔右側(cè)頸總動脈建立梭形動脈瘤模型，7、14、21 d時分別行DSA檢測、HE染色、彈力纖維染色觀察模型動物的影像學(xué)和病理學(xué)變化。結(jié)果DSA造影顯示正常對照組血管直徑（1.64±0.17）mm；0.9%氯化鈉溶液對照組血管直徑（1.66±0.24）mm。7 d組動脈瘤長徑和寬徑分別為（19.33±1.65）mm和（2.86±0.21）mm；14 d組分別為（19.66±1.18）mm和（3.95±0.54）mm；21 d組分別為（19.84±0.82）mm和（4.03±0.95）mm。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)7 d組梭形動脈瘤模型內(nèi)彈力膜斷裂，中膜平滑肌結(jié)構(gòu)絮亂，細(xì)胞形態(tài)扭曲；14 d組梭形動脈瘤模型瘤腔內(nèi)膜逐漸增生穩(wěn)定；21 d組梭形動脈瘤模型瘤頸與瘤腔交界處結(jié)構(gòu)的變化明顯。彈力纖維染色顯示7 d組梭形動脈瘤模型彈力層明顯變?。?4 d組從交界處始彈力層逐漸變?。?1 d組變薄的彈力層基本穩(wěn)定。結(jié)論利用簡單外科手術(shù)方法結(jié)合豬胰彈性蛋白酶消化局部血管壁，可以建立形態(tài)學(xué)與人顱內(nèi)動脈瘤相似的梭形動脈瘤模型，且動脈瘤模型與人顱內(nèi)動脈瘤病理結(jié)構(gòu)相似。

動脈瘤；彈性蛋白酶；動物模型

顱內(nèi)動脈瘤是較常見的嚴(yán)重腦血管病。顱內(nèi)動脈瘤破裂出血后會并發(fā)危及生命的腦血管痙攣、再出血和急性腦積水等并發(fā)癥，具有較高的病死率和致殘率［1］。其形成、生長、破裂等機制尚不清楚［2］。梭形動脈瘤是顱內(nèi)動脈瘤中比較少見的一類動脈瘤，占顱內(nèi)動脈瘤的3%～13%［3］。由于特殊的形態(tài)和地位，其治療難度較大，風(fēng)險也比其他顱內(nèi)動脈瘤高。隨著顱內(nèi)動脈瘤介入治療材料的不斷發(fā)展，如何建立類似于人的顱內(nèi)動脈瘤實驗動物模型對于研究動脈瘤的形態(tài)結(jié)構(gòu)、組織結(jié)構(gòu)以及介入材料的研發(fā)顯得十分重要。本研究報道利用豬胰彈性蛋白酶消化兔右側(cè)頸總動脈，建立與人類顱內(nèi)動脈瘤形態(tài)學(xué)和病理學(xué)相似的梭形動脈瘤模型，并進(jìn)行相關(guān)分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康新西蘭大白兔25只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。將動物隨機分為正常對照組5只、0.9%氯化鈉溶液對照組5只和實驗組15只，實驗組再隨機分為7、14和21 d 3個亞組，每組5只。

1.2 動物模型制備

動物術(shù)前12 h禁食，用速眠新（0.1m l/kg）聯(lián)合1%戊巴比妥（10 mg/kg）靜脈注射麻醉后，沿頸前正中切口，充分暴露右側(cè)頸總動脈，游離出頸總動脈，用外科手術(shù)無菌手套制作大小10 mm×28 mm乳膠片，墊于游離出的頸總動脈下，兩端用1號手術(shù)切口縫合線結(jié)扎形成一凹槽，限定凹槽長度為20 mm，向凹槽內(nèi)注入豬胰彈性蛋白酶（上海林葉生物科技有限公司）80 u，待消化20 min后，吸干殘留豬胰彈性蛋白酶，松開兩端結(jié)扎線，用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗數(shù)次，取出乳膠片，逐層縫合皮膚。對照組用生理鹽水代替豬胰彈性蛋白酶，操作步驟同實驗組（圖1）。

圖1 動物模型建立過程

1.3 影像學(xué)檢查

實驗組和對照組分別在7、14和21 d處死前行靜脈數(shù)字減影血管造影（IVDSA）檢查。使用的DSA機器（Philps Allura Xper FD20）自帶軟件測量梭形動脈瘤長徑、寬徑（圖2a）。

1.4 組織學(xué)檢查

實驗組與對照組分別在7、14、21 d造影后灌注處死，取出右側(cè)頸總動脈動脈瘤標(biāo)本置4%多聚甲醛固定24 h以上（圖2b），常規(guī)石蠟包埋，切片行HE染色、彈力纖維染色。

圖2 21 d時梭形動脈瘤模型的造影

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用x±s表示，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，組間兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

采用簡單的外科手法，結(jié)合豬胰彈性蛋白酶局部消化包裹實驗兔右側(cè)頸總動脈壁，20 min后即可見動脈局部膨脹，血管壁呈暗紅色，動脈瘤搏動明顯。

2.1 對照組和實驗組術(shù)后病理所見

0.9 %氯化鈉溶液對照組術(shù)后7、14和21 d時大體解剖發(fā)現(xiàn)右側(cè)頸總動脈與周圍組織無粘連，血管壁無膨脹，搏動正常。0.9%氯化鈉溶液對照組和正常對照組頸總動脈冠狀切片HE染色顯示血管壁內(nèi)膜、中膜、外膜分層清楚，彈性纖維染色見10余層彈性層，結(jié)構(gòu)完整。實驗組術(shù)后7、14和21 d時造影后灌注解剖發(fā)現(xiàn)右側(cè)頸總動脈與周圍組織輕度粘連，頸總動脈局部形成梭形凸起，搏動明顯。HE染色顯示7 d組的梭形動脈瘤模型內(nèi)膜相對減少變??；14 d組的模型瘤腔內(nèi)膜逐漸增生；21 d組梭形動脈瘤模型增生的內(nèi)膜增生趨于穩(wěn)定（圖3）。彈力纖維染色顯示7 d組梭形動脈瘤模型彈力層明顯變薄，14 d組從交界處始彈力層逐漸變?。?1 d組從交界處始彈力層基本穩(wěn)定（圖4）。

圖3 對照組和實驗組術(shù)后頸總動脈膜結(jié)構(gòu)變化（HE，×200）

圖4 對照組和實驗組術(shù)后頸總動脈彈力層變化（彈力纖維染色，×200）

2.2對照組和實驗組影像學(xué)表現(xiàn)

與0.9%氯化鈉溶液對照組相比，實驗組在豬胰彈力酶消化前血管直徑無明顯區(qū)別；0.9%氯化鈉溶液對照組在消化20 min后血管直徑增大不明顯；而實驗組在消化20min后及7、14和21 d后的血管直徑明顯增大。造模后7 d，經(jīng)兔耳緣靜脈造影檢查測量正常對照組血管直徑為（1.64±0.17）mm；0.9%氯化鈉溶液對照組血管直徑為（1.66±0.24）mm；實驗組7 d動脈瘤長徑平均值為（19.33±1.65）mm，寬徑平均值為（2.86±0.21）mm；14 d造影檢查測量動脈瘤長徑平均值為（19.66±1.18）mm，寬徑平均值為（3.95±0.54）mm；21 d造影檢查測量動脈瘤長徑平均值為（19.84±0.82）mm，寬徑平均值為（4.03± 0.95）mm。實驗組術(shù)后7、14、21 d造影的動脈瘤長徑間的兩兩比較應(yīng)用配對樣本t檢驗，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。正常對照組與0.9%氯化鈉溶液對照組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；實驗組14 d組與21 d組組間比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余實驗組與正常對照組和0.9%氯化鈉溶液對照組兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

近年，利用彈性蛋白酶誘導(dǎo)以制作實驗動物動脈瘤模型的研究較為流行［4］。在顱內(nèi)動脈瘤實驗動物模型的研究中，Aassar等［5］通過對彈性蛋白酶誘導(dǎo)的兔頸動脈囊狀動脈瘤的病理學(xué)和分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該模型在血流動力學(xué)和組織病理學(xué)方面都非常接近人類顱內(nèi)囊狀動脈瘤，相對采用高血壓和血管吻合技術(shù)制作的動脈瘤模型更為理想。在利用實驗動物的頸總動脈經(jīng)過彈性蛋白酶消化以誘導(dǎo)出所需的動脈瘤模型的研究中，大部分以囊形動脈瘤為主。梭形動脈瘤模型的研究相對較少。早期，國內(nèi)有學(xué)者通過結(jié)扎大鼠一側(cè)頸外動脈，利用游離近端插管向頸總動脈腔內(nèi)注入彈性蛋白酶，成功地誘導(dǎo)出梭形動脈瘤，但其結(jié)扎了大鼠的一側(cè)頸外動脈，在一定的程度上改變了局部血流的走向［6］。Reinald等［7］用不同劑量的彈力酶通過兔右側(cè)頸總動脈血管腔內(nèi)消化制作梭形動脈瘤模型，并通過鑒定平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和MMP-9的表達(dá)，確定3U的彈力酶是觀察動脈瘤形態(tài)、彈力纖維破壞的最佳劑量，彈力酶消化4周后，可見巨噬細(xì)胞浸潤，同時也指出該模型并未清晰地展示人類顱內(nèi)動脈瘤伴隨的動脈粥樣硬化改變過程。Bhamidipati等［8］將彈力酶局部浸潤大鼠的腹主動脈也能制作出較為成功的腹主動脈動脈瘤。而通過顯微外科嫁接靜脈建立梭形動脈瘤則是一種較成功的梭形動脈瘤模型構(gòu)建方法，但其組織結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于原發(fā)動脈瘤，具有不易自發(fā)破裂的缺陷［9］。國內(nèi)學(xué)者采用靜脈囊移植方法在犬頸總動脈建立梭形動脈瘤，用以評價支架材料在動脈瘤模型中的應(yīng)用價值，并指出該種動脈瘤模型制作過程操作復(fù)雜且與人類動脈瘤模型的病理變化不完全一致［10］。也有學(xué)者在血管結(jié)扎結(jié)合彈力酶誘導(dǎo)法和外科縫合靜脈移植法制作的兔囊狀動脈瘤模型比較中發(fā)現(xiàn)，血管結(jié)扎結(jié)合彈力酶誘導(dǎo)法制作的動脈瘤模型在組織上相對外科縫合靜脈移植法更接近于自然發(fā)病的動脈瘤［11］。

本實驗利用彈性蛋白酶結(jié)合簡易的外科手術(shù)所建立的梭形動脈瘤模型具有如下特點:①沒有阻斷動脈血管腔內(nèi)血流，各分支血管血液流向均無大改變，更符合顱內(nèi)動脈瘤的血流動力學(xué)特點。②大鼠頸總動脈梭形動脈瘤造模前后及術(shù)中均未使用肝素等抗凝劑，實驗兔的血壓基本上也未發(fā)生較大波動，病理學(xué)改變上更接近于人類梭形動脈瘤在生理環(huán)境中受血流動力學(xué)作用機制所造成的真實病理損害。③本梭形動脈瘤模型的長度得到了很好的控制，通過簡單的外科結(jié)扎能夠造出理想長度的梭形動脈瘤模型。④該造模方法操作簡便，造模成功率較高，制作的梭形動脈瘤模型形態(tài)學(xué)和大小與顱內(nèi)動脈瘤相似，適用于梭形動脈瘤的形成機制、病理學(xué)以及介入材料的進(jìn)一步研究。

在兔頸總動脈梭形動脈瘤造模后動脈瘤形態(tài)和病理學(xué)觀測時間點的選擇上，Krings等［12］研究發(fā)現(xiàn)彈力酶誘導(dǎo)的兔動脈瘤模型影像學(xué)上2～3周趨于穩(wěn)定。綜上，我們分別在7、14和21 d對兔進(jìn)行動脈血管造影和灌注取材。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過約3周的血流沖擊，兔的頸總動脈梭形動脈瘤具有明顯的增大趨勢。病理學(xué)改變也發(fā)生著一定的變化，如瘤頸處彈力層較完整，但是遠(yuǎn)端彈力層破壞較嚴(yán)重。本實驗中彈力酶誘導(dǎo)術(shù)后7 d彈性纖維染色可見動脈瘤壁變薄，血管彈力層在瘤頸口處突然斷裂，這與Abruzzo等［13］報道的病理結(jié)果符合。

本實驗中HE染色顯示對照組正常頸總動脈內(nèi)膜、中膜、外膜結(jié)構(gòu)完整。彈力蛋白酶誘導(dǎo)后7 d顯示梭形動脈瘤模型內(nèi)彈力膜斷裂，中膜平滑肌結(jié)構(gòu)絮亂，細(xì)胞形態(tài)扭曲；14 d梭形動脈瘤模型瘤腔內(nèi)膜逐漸增生；21 d梭形動脈瘤模型增生的內(nèi)膜增生趨于穩(wěn)定。彈力纖維染色顯示對照組頸總動脈彈力層完整；7 d梭形動脈瘤模型彈力層明顯變??；14 d從交界處始彈力層逐漸變??；21 d從交界處始彈力層基本穩(wěn)定。其血管內(nèi)膜及彈力層的演變過程可能是在彈力蛋白酶的消化作用下血管壁的彈力層被破壞，隨著血流的沖擊，以及血壓的作用，血管壁逐漸膨脹，內(nèi)膜相對減少變薄，而隨著時間的推移，血管膨脹趨于穩(wěn)定，內(nèi)膜開始逐漸代償性增生。

造模前預(yù)先限定了梭形動脈瘤的長度，故實驗組各時間段內(nèi)的兔耳緣靜脈血管造影顯示梭形動脈瘤長徑的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明該造模方法能夠制作出理想長度的梭形動脈瘤。在嚴(yán)格控制豬胰彈性蛋白酶注入量的基礎(chǔ)上，7 d的梭形動脈瘤模型寬徑與14 d梭形動脈瘤寬徑的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而14 d的梭形動脈瘤模型寬徑與21 d梭形動脈瘤寬徑的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明在血管外膜以及彈力層損傷的情況下，經(jīng)過14 d里血流動力學(xué)的作用，動脈瘤寬徑明顯增大，而隨著時間的推移內(nèi)膜增生，彈力層逐漸穩(wěn)定，動脈瘤的膨脹趨于緩慢，該過程類似于人類顱內(nèi)動脈瘤的自發(fā)性生長過程。雖然本實驗中沒有發(fā)現(xiàn)動脈瘤模型的術(shù)后自發(fā)破裂，但其是否具有自發(fā)破裂可能則需要更長期的隨訪。

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Preparation of fusiform aneu rysm smodel in rabbits

ZHANG Lian-fu，XU Shan-shui，F(xiàn)ANG Xing-gen， LIZi-fu，JIANG Guo-quan.Department of Neurosurgery，Second People's Hospital of Anhui Province，Hefei，Anhui Province 230041，China

FANG Xing-gen，E-mail:fangxinggen@gmail.com

ObjectiveTo establish the carotid fusiform aneurysm model in rabbits carrying similar characteristics of human intracranial aneurysms by using induction method withporcinepancreatic elastase. M ethods Twenty-five New Zealand white rabbitswere random ly divided into normal control group（n=5），saline control group（n=5）and study group（n=15）.The rabbits of the study groupwere random ly and equally subdivided into 7-day subgroup，14-day subgroupand 21-day subgroup.By using induction method withporcinepancreatic elastase to digest right common carotid the fusiform aneurysm model was established in all the rabbits of the study group.DSA examination，HE staining and elastic fiber stainingpathologic examination were carried out at 7，14 and 21 days after theprocedure to observe the imaging andpathologic changes of the fusiform aneurysm models.ResultsDSA angiography showed that the mean vascular diameters of the normal control groupand the saline control groupwere（1.64±0.17）mm and（1.66± 0.24）mm respectively.Themean length and width of the fusiform aneurysm of the 7-day subgroup，14-day subgroupand 21-day subgroupwere（19.33±1.65）mm and（2.86±0.21）mm，（19.66±1.18）mm and（3.95±0.54）mm，and（19.84±0.82）mm and（4.03±0.95）mm，respectively.Pathologically，rupture of internal elastic membrane，disordered structure of tunicamedia smooth muscle and distortion of cell shape were observed in the rabbits of 7-day subgroup. Gradually stabilized aneurysmal lumen intimal hyperplasia was seen in the rabbits of 14-day subgroup.Remarkable structure changes at the aneurysmal neck-cavity junction were found in the rabbits of 21-day subgroup.Elastic fiber staining demonstrated that strikingly thinnedelastic layerwas observed in the rabbits of 7-day subgroup，gradually thinning elastic layer at the aneurysmal neck-cavity junction was seen in the rabbits of 14-day subgroup，and the thinned elastic layer became stable in the rabbits of 21-day subgroup.ConclusionUsing simple surgical method combined withporcinepancreatic elastase to digest vascular wall，carotid fusiform aneurysm models can be reliably established in New Zealand white rabbits which carry similar morphologic andpathologic characteristics of human intracranial aneurysms（JIntervent Radiol，2014，23:711-715）

aneurysm；elastase；animalmodel

R743.4

B

1008-794X（2014）-08-0711-05

2013-10-28）

（本文編輯:侯虹魯）

10.3969/j.issn.1008-794X.2014.08.014

弋磯山醫(yī)院人才引進(jìn)基金（YR201105）

230041合肥安徽省第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科（張連富）；安徽蕪湖皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院神經(jīng)外科（徐善水、方興根、江國權(quán)）；上海第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院神經(jīng)外科（李子付）

方興根E-mail:fangxinggen@gmail.com