陳奕霞，彭頌國(guó)，蘇秀瓊 (.廣東省惠州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 惠州 5600;.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 中山50060)

PCR定量檢測(cè)肺炎支原體在肺炎支原體肺炎中的應(yīng)用分析

陳奕霞1，彭頌國(guó)2，蘇秀瓊1(1.廣東省惠州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 惠州 516001;2.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 中山510060)

目的：探討PCR定量檢測(cè)在肺炎支原體肺炎診斷中的可行性及優(yōu)越性。方法：選取186例接受治療的肺炎患者，分別用MP快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行檢測(cè)。記錄并比較兩組檢測(cè)方法下的靈敏度及特異性等相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果：快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)PCR法診斷肺炎支原體肺炎的靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、假陰性率及診斷符合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)時(shí)PCR法診斷肺炎支原體肺炎的特異性為85.5%(65/76)，明顯高于快速培養(yǎng)法的77.6%(59/76)，假陽(yáng)性率為14.5%(11/76)，明顯低于快速培養(yǎng)法的22.4%(17/76)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)PCR法診斷肺炎支原體肺炎的敏感度差別不大，而實(shí)時(shí)PCR法的特異性優(yōu)于快速培養(yǎng)法。臨床上應(yīng)用這兩種不同原理的檢測(cè)方法組合檢測(cè)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，在提高肺炎支原體感染檢出率的同時(shí)，還可以互相佐證，減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

PCR定量檢測(cè);肺炎;支原體;陽(yáng)性預(yù)測(cè)值

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae，MP)是一種最常見的病原體，易侵入小兒體內(nèi)導(dǎo)致呼吸道受到感染［1］。肺炎支原體臨床表現(xiàn)多樣，以各種呼吸道器官炎性反應(yīng)最為多見，如咽炎、肺炎等［2］。此外，肺炎支原體還會(huì)導(dǎo)致呼吸器官外的全身各臟器受損，對(duì)兒童身體的危害性極大。近年嬰幼兒感染率達(dá)25% ～69%，并且感染率還有逐年上升的趨勢(shì)［3］。目前檢測(cè)MP的方法并不唯一。以前臨床診斷MP感染一般采用血清學(xué)方法，但檢測(cè)結(jié)果易受多方面因素的影響，如患者的身體狀況、病情的嚴(yán)重程度等，使得早期診斷MP感染的難度增加［4］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)實(shí)時(shí)PCR法廣泛應(yīng)用于肺炎支原體的檢測(cè)中。該法不受患者自身病情的影響，能快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)到肺炎支原體的存在。本文對(duì)PCR定量檢測(cè)法和其他檢測(cè)法進(jìn)行了對(duì)比，旨在探討該法在臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取186例于2012年11月～2013年7月在我院接受治療的肺炎患者。其中男111例，女75例。年齡范圍為3個(gè)月～17歲，平均(5±4.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①持續(xù)劇烈咳嗽;②全身癥狀比胸部體征明顯;③X射線所見較體征顯著，胸片可見片狀陰影的出現(xiàn)，肺門陰影增濃;④白細(xì)胞數(shù)量正?；蛏晕⑵撸炼嘣隹?⑤用大環(huán)內(nèi)酯類藥治療病情迅速緩解。⑥均有肺炎癥狀和(或)體征，經(jīng)一般抗生素及抗病毒藥物治療無(wú)效。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有呼吸系統(tǒng)疾的患者;②患心臟病者;③有精神系統(tǒng)疾患病史及家族史的患者。

1.2 診斷方法：所有患者均于住院當(dāng)天無(wú)菌采集咽試子標(biāo)本，分別用MP快速培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行檢測(cè)。MP快速培養(yǎng)：將咽拭子置于培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)攪動(dòng)數(shù)次后，取出咽拭子，密封瓶蓋，置于37℃孵箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)：向咽拭子中加入1 ml無(wú)菌生理鹽水混勻。然后高速離心10 min，舍去上清向離心管內(nèi)加入120 μl的DNA濃縮液混勻。再接著高速離心10 min，棄上清向離心管內(nèi)加入25 μl DNA提取液。然后100℃恒溫處理10 min，高速離心5 min，取3ul進(jìn)行PCR反應(yīng)測(cè)定。

1.3 觀察指標(biāo)：記錄并比較兩組檢測(cè)方法下的靈敏度及特異性等相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)均由SASS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析。組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同性別的MP陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果：MP快速培養(yǎng)法檢出的陽(yáng)性結(jié)果為107例，其中男67例，感染率為58.6%(67/111)，女42例，感染率為56.0%(42/75);實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)出的陽(yáng)性患者為104例，其中男63例，感染率為56.8%(63/111)，女41例，感染率為54.7%(41/75)。這兩組數(shù)據(jù)表明無(wú)論用哪種方法檢測(cè)，男性與女性的MP感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 快速培養(yǎng)法檢測(cè)MP結(jié)果和臨床診斷結(jié)果比較：見表2，快速培養(yǎng)法對(duì)肺炎支原體肺炎診斷的靈敏度、特異度分別為81.8%(90/110)、77.6%(59/76)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(NPV)分別為84.1%(90/107)和74.7%(59/79)，假陽(yáng)性率、假陰性率分別為22.4%(17/76)、18.2%(20/110)，診斷符合率為80.1%(149/186)。

表1 不同性別的MP陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果［例(%)］

表2 快速培養(yǎng)法檢測(cè)MP結(jié)果和臨床診斷結(jié)果比較(例)

2.3 實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)MP結(jié)果和臨床診斷結(jié)果比較：見表2，實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)MP對(duì)肺炎支原體肺炎診斷的靈敏度、特異度分別為84.5%(93/110)、85.5%(65/76) ，PPV、NPV分別為89.4%(93/104)和79.3%(65/82)，假陽(yáng)性率、假陰性率分別為14.5%(11/76)、15.5%(17/110)，診斷符合率為84.9%(158/186) ，見表2。

表3 實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)MP結(jié)果和臨床診斷結(jié)果比較(例)

2.4 實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)與快速培養(yǎng)法檢測(cè)MP的比較：將表2、3的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法的靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、假陰性率和診斷符合率的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)時(shí)PCR法診斷肺炎支原體肺炎的特異度為85.5%(65/76)，明顯高于快速培養(yǎng)法的77.6%(59/76)，假陽(yáng)性率為14.5%(11/76)，明顯低于快速培養(yǎng)法的22.4%(17/76)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

近年來(lái)，導(dǎo)致兒童出現(xiàn)肺炎的主要病原體即為MP，其臨床癥狀不典型，易導(dǎo)致誤診、漏診，故早期診斷、及時(shí)治療非常重要［5］。流行病學(xué)資料顯示，MP感染主要通過(guò)呼吸道飛沫傳播，易感人群是4～20歲，嬰幼兒也可發(fā)?。?］。該病原體的發(fā)病年齡和易感年齡并不一致，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，學(xué)齡前兒童和學(xué)齡兒童最易發(fā)病［7］。本研究不同性別的MP陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果表明，雖然肺炎支原體肺炎的發(fā)病年齡集中在齡前兒童和學(xué)齡兒童期，但其發(fā)病與性別無(wú)關(guān)，男女的發(fā)病率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。新生兒MP發(fā)病初期缺乏特異的臨床特征，多以上呼吸道感染開始，肺部X線表現(xiàn)多樣，以肺紋理增多為主。痰、鼻和咽拭子培養(yǎng)可獲肺炎支原體，臨床上一般采用該方法進(jìn)行診斷［8］。但是支原體在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度緩慢，達(dá)到能檢測(cè)到的標(biāo)準(zhǔn)用時(shí)較長(zhǎng)，難以滿足早期診斷要求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在支原體研究領(lǐng)域的應(yīng)用，PCR技術(shù)已經(jīng)成為較快檢測(cè)支原體感染的方法。實(shí)時(shí)PCR整個(gè)操作只要數(shù)個(gè)小時(shí)，且可減少假陽(yáng)性的干擾，亦可了解MP在患兒體內(nèi)的復(fù)制情況［9］。

快速培養(yǎng)法是近年發(fā)展起來(lái)的一種直接檢測(cè)MP病原體的實(shí)驗(yàn)室方法，具有簡(jiǎn)便，快速，敏感的優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)檫@種培養(yǎng)液里面添加了高營(yíng)養(yǎng)成分和快速生長(zhǎng)因子，即使加入極少量的支原體也可以在短時(shí)間內(nèi)快速增殖，一天內(nèi)即可得到結(jié)果。所以該方法在發(fā)病初期也能檢測(cè)得到MP［10］。本研究結(jié)果顯示，快速培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)PCR法診斷肺炎支原體肺炎的靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、假陰性率及診斷符合率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?？焖倥囵B(yǎng)法雖然比一般的培養(yǎng)時(shí)間大大縮短，但是其與實(shí)時(shí)PCR法相比特異性較低、出現(xiàn)假陽(yáng)性的比例較大。本研究結(jié)果顯示，快速培養(yǎng)法的特異性為77.6%(59/76)，假陽(yáng)性比例為22.4%(17/76)，與實(shí)時(shí)PCR的85.5%(65/76)和14.5%(11/76)相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。分析出現(xiàn)這兩點(diǎn)差異的可能原因?yàn)椋孩倏赡芘c快速培養(yǎng)法使用的培養(yǎng)液有關(guān)，標(biāo)本中的真菌也能在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)引起假陽(yáng)性;②快速培養(yǎng)法只有在MP存活的情況下才能夠檢出，而PCR法并不依賴這一點(diǎn)。

綜上所述，實(shí)時(shí)PCR可快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)到患者體內(nèi)的MP，值得在臨床上推廣應(yīng)用，為肺炎支原體肺炎的早期診斷、治療提供重要的依據(jù)。然而該方法也存在不足之處，盡管PCR技術(shù)不斷改善，但僅靠這一種方法診斷MP感染是不夠的，并且該方法易受標(biāo)本來(lái)源和試劑特異性的影響。如能將多方法結(jié)合用于MP感染的早期檢測(cè)，不但有利于疾病的診斷，而且可以有效地避免漏檢，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，為臨床醫(yī)生提供快速可靠的檢驗(yàn)依據(jù)。

［1］周喜友，肖克林，袁康凱.實(shí)時(shí)PCR和顆粒凝集法檢測(cè)兒童呼吸道肺炎支原體感染［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，12(9)：701.

［2］吳衍恒，劉洪波，師舞陽(yáng)，等.Real－time PCR技術(shù)在呼吸道病毒檢測(cè)中的應(yīng)用與分析［J］.公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，12(1)：96.

［3］徐 俊，繆美華，張學(xué)蘭，等.蘇州地區(qū)人博卡病毒在兒童急性呼吸道感染中的流行特征［J］.分子診斷與治療雜志，2012，4(5)：314.

［4］林耀堂，陳海熒.三種肺炎支原體特異性抗體IgM檢測(cè)方法結(jié)果的比較［J］. 吉林醫(yī)學(xué)，2013，34(16)：3144.

［5］張團(tuán)結(jié)，孫 征.三種肺炎支原體檢測(cè)方法特點(diǎn)比較［J］. 山東醫(yī)藥，2011，51(47)：26.

［6］陳 沁，裘敏燕，付永鋒，等.4種呼吸道病毒懸液芯片檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2013，12(2)：97，130.

［7］文慣宇，李 丹，趙德育，等.12438例呼吸道感染住院患兒MP熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果分析［J］.江蘇醫(yī)藥，2012，38(21)：2587.

［8］巫素婷.三種方法檢測(cè)兒童肺炎支原體的比較分析［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2012，34(7)：933.

［9］杜忠祥.肺炎支原體IgM、CRP聯(lián)合檢測(cè)在支原體肺炎中的應(yīng)用探討［J］. 吉林醫(yī)學(xué)，2012，33(3)：484.

［10］苑 鑫.肺炎支原體感染檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.軍事醫(yī)學(xué)，2012，36(4)：316.

Application Analysis of Quantitative PCR detection of Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pneumoniae pneumonia

CHEN Yi－xia，PENG Song－guo，SUN Xiu－qiong(1.Huizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong516001，China;2.Affiliated Cancer Hospital of Sun Yat－sen，Guangzhou510060，China)

ObjectiveTo investigate the quantitative PCR in the diagnosis of mycoplasma pneumonia feasibility and superiority.Methods186 cases of patients with pneumonia were treated with MP rapid culture method and the real－time PCR testing respectively.the sensitivity and specificity of two methods data were compared.ResultsThe diagnosis of mycoplasma pneumonia sensitivity，positive predictive value，false negative rate and diagnostic accuracy of rapid culture method and real－ time PCR had no significant difference(P＞0.05);mycoplasma pneumonia diagnosis specificity of Real－ time PCR was 85.5%(65/76)，significantly higher than 77.6%of rapid culture(59/76)，the false positive rate was 14.5%(11/76)，significantly lower than the 22.4%of rapid culture(17/76)，the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionsThe rapid culture method and real－time PCR diagnosis of mycoplasma pneumonia sensitivity have no different，but the specificity of real－ time PCR method is superior to rapid culture method.The clinical application of the principles of these two different combinations can improve the detection rate of Mycoplasma pneumoniae infection，while also supporting each other，to reduce experimental error and improve the accuracy of detection.

Quantitative PCR;Pneumonia;Mycoplasma;Positive predictive value

2013－08－05 編校：李曉飛］