蘭艷素，趙 嚴(yán)，張婷婷，桂 生，任文強(qiáng)

（黃山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 黃山 245041）

苦參為豆科植物，在國內(nèi)各省區(qū)均有分布，而且產(chǎn)量較高。[1]研究發(fā)現(xiàn)苦參具有減緩心率、擴(kuò)張血管平喘以及消炎等作用，經(jīng)常被用于治療熱痢、便血、皮膚瘙癢、滴蟲性陰道炎等[2]，是我國應(yīng)用比較廣的傳統(tǒng)中藥。[3]

苦參中黃酮類成分的含量較高，到目前為止，已經(jīng)從苦參中分離得到100余種黃酮類化合物[4]，研究結(jié)果顯示，苦參中所含的黃酮類化合物不僅具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗心率失常、祛痰等作用[5]，還在降低血糖和抗糖尿病并發(fā)癥等方面具有比較好的活性[6]。

本文采用微波法進(jìn)行提取，Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化苦參總黃酮的提取工藝參數(shù)，以期為苦參的進(jìn)一步研究提供一定的參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

苦參購于安徽亳州（批號：110601），經(jīng)鑒定為豆科槐屬植物苦參Sophora flavescenes Ait.的干燥根，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號：10080-200707，購于中國藥品生物制品檢定所)；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 儀器

UV-2100型紫外可見分光光度計（北京北分瑞利分析儀器有限公司）；MCR-3S型常壓微波合成萃取儀 （鞏義市予華儀器有限公司）；高速離心機(jī)TG165（長沙平凡儀器儀表有限公司）；電子分析天平 (上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；GZX-9030MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FW100型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取10.2mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶解后，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，最后用60%乙醇定容至刻度線，搖勻即得濃度為0.204mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5mL，混合均勻，放置6min，然后加入10%硝酸鋁溶液0.5mL，搖勻后放置6min，最后加4%的氫氧化鈉溶液4mL，用60%乙醇溶液定容至刻度線，混勻，靜置15min后，在510nm波長處測定溶液吸光度值。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=11.2382C-0.0302，R2=0.9997，線性關(guān)系良好。

2.2 苦參總黃酮的提取及測定

稱取已經(jīng)處理好的苦參粉末，置于250mL干燥的圓底燒瓶中，加入適量、一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，浸泡苦參藥材1h后，在一定的微波功率下提取一定時間，所得提取溶液冷卻后，低速離心機(jī)離心8min，過濾，移取過濾后提取液5mL，用乙醇定容于25mL容量瓶中作為待測溶液，再用移液管量取2.0mL待測液置于10mL容量瓶中，按2.1項下的實驗方法進(jìn)行顯色后測定吸光度值，最后按照下式計算出苦參總黃酮的得率(以蘆丁計)。

C為標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的總黃酮濃度(mg/mL)；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積(mL)；M為樣品質(zhì)量（g）。

2.3 單因素試驗

參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，試驗選定4個單因素分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、液料比和微波功率，考察各因素對苦參總黃酮提取率的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗結(jié)果

3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

由圖1可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%和60%時，總黃酮的提取率均比較低，且相差不大。之后總黃酮提取率隨乙醇含量的增加而迅速增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時，總黃酮的提取率達(dá)到最大值。綜合考慮，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

3.1.2 提取時間對總黃酮提取率的影響

圖2 提取時間對黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著提取時間的延長，總黃酮提取量緩慢增加，當(dāng)提取時間為6min時，提取率為13.32mg/g，相對較高，但若超過6min，苦參中總黃酮提取量反而減少，因此提取時間選取6min。

3.1.3 液料比對總黃酮提取率的影響

圖3 液料比對黃酮提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)液料比在15：1到25：1之間變化時，黃酮提取率隨著液料比的擴(kuò)大而快速增加，當(dāng)液料比為25：1時提取率達(dá)到最大值，之后緩慢減少。原因可能是當(dāng)苦參藥材量一定，加入乙醇溶液的量越多，可以使藥材和溶劑的接觸越充分，非常有利于黃酮成分的溶出，黃酮提取率越高，但當(dāng)乙醇量達(dá)到一定程度后，促進(jìn)作用就沒有那么明顯了，綜合考慮，選取液料比為25：1。

3.1.4 微波功率對總黃酮提取率的影響

圖4 微波功率對黃酮提取率的影響

由圖4可見，隨著微波功率的增加，總黃酮提取率呈先上升后下降，在400W時總黃酮的提取量最大，但當(dāng)微波功率大于400W時，卻呈現(xiàn)出快速下降趨勢，可能是因為微波功率過大，溫度升高較快，過高的能量會破壞已經(jīng)提取得到的黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，因而選取微波功率為400W。

3.2 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

3.2.1 實驗設(shè)計與結(jié)果

在單因素試驗所得數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，以苦參總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計，并以1、0、-1表示自變量的高低水平，各因素水平編碼見表1，實驗結(jié)果見表2。

表1 因素水平編碼表

表2 實驗設(shè)計與結(jié)果

3.2.2 模型方程的建立及顯著性檢驗

利用Design Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合后，得到回歸模型方程Y=12.69+0.1742X1+0.1450X2+0.2525X3+0.0417X4-0.1300X1X2-0.1150X1X3+0.01750X1X4-0.03250X2X3-0.1225X2X4+0.035X3X4-0.7088-0.1351-0.5413-0.5176。

表3 苦參總黃酮提取率方差分析結(jié)果

由表3可知，模型的F值為20.04，P〈0.0001，表明實驗所得的回歸模型方程極顯著。液料比的P〈0.0001，影響極顯著，即液料比的改變對總黃酮提取率的影響最強(qiáng)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間次之，微波功率的影響最不顯著。二次項中對響應(yīng)值的影響均達(dá)極顯著水平，的偏回歸系數(shù)達(dá)差異顯著水平。方程的交互項均未達(dá)到顯著水平(P〉0.05)，說明因素之間的交互作用對黃酮提取率的影響較小。

該模型方程的失擬項P=0.3138，影響不顯著，因此可以對苦參總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化及預(yù)測。

3.2.3 效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測

利用Design-Expert8.0.6軟件，以黃酮提取率為響應(yīng)值，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時間、液料比、微波功率其中之一為中心點值，繪制得到影響較顯著的三維效應(yīng)曲面見圖5。

圖5 各因素交互作用影響黃酮得率的響應(yīng)面曲線圖

圖5A為微波功率與液料比對黃酮提取率的交互影響曲面圖，由圖可知，隨著液料比、微波功率的增加，黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在微波功率在400W左右、液料比在25：1附近存在最佳點。觀察圖5B可看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率對黃酮提取率的交互作用影響曲面開口向下，影響比較顯著，隨著微波功率提高和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，總黃酮提取率速率增加達(dá)到最高點后緩慢下降。圖5C中顯示，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用響應(yīng)面彎曲度較大，表明這兩個因素的交互作用對苦參總黃酮提取率具有顯著影響，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，提取率也很低，之后呈現(xiàn)先快速升高后快速減少的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、液料比為25：1時，總黃酮提取率最高。

通過軟件分析，預(yù)測總黃酮提取率最大值為12.75mg/g，微波法輔助提取苦參總黃酮的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80.61%，提取時間6.4min，液料比 26.06：1mL/g，微波功率 399.3W。

為了便于操作，將工藝條件取整修正，并在修正后的條件下做平行實驗5次，測得平均總黃酮提取率為12.67mg/g，與預(yù)測值相符。

4 結(jié) 論

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Design Expert8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，并采用響應(yīng)面分析法對微波輔助提取苦參總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時間 6min，液料比 25：1(mL/g)，微波功率400W，在該工藝條件下，總黃酮提取率為12.67mg/g，比模型預(yù)測值少0.08mg/g，相對誤差為-0.6%。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的苦參總黃酮的提取工藝可靠，具有較高的應(yīng)用價值。

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