黃卓文

(廣州市高級技工學(xué)校,廣東廣州 510420)

檢測雞痘病毒抗體間接ELISA方法的建立

黃卓文

(廣州市高級技工學(xué)校,廣東廣州 510420)

應(yīng)用雞胚成纖維細胞(CEF)擴增雞痘病毒(Fowlpox virus,FPV)并提純后作為抗原建立了具有較高特異性和靈敏性的間接ELISA方法。通過方陣滴定法來確定抗原最佳稀釋倍數(shù)為1：1600,待檢血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶100。并檢測50份FPV免疫實驗雞血清用本方法進行檢測,其陽性檢出率為84%(42/50)。

間接ELISA；雞痘病毒；抗體

雞痘是由FPV引起的雞的一種接觸性傳染病。本病分布于世界各地，特別是大型雞場中更易流行，可使雞生長遲緩、消瘦、產(chǎn)蛋量下降。若并發(fā)其它傳染病、寄生蟲病和衛(wèi)生條件、營養(yǎng)狀況不良時，可引起大批死亡，尤其對雛雞造成更嚴重的損失，使用疫苗進行免疫預(yù)防是控制本病的重要措施[1]。

檢測雞血清中雞痘抗體，可以了解疫苗免疫狀況和機體感染情況。另外，F(xiàn)PV被越來越多用做載體構(gòu)建基因工程疫苗，用于動物的免疫預(yù)防，所以，通過抗體的檢測還可以間接評價重組雞痘病毒對試驗動物的免疫狀態(tài)。雞痘病毒抗體的血清學(xué)檢測方法主要有免疫擴散試驗、被動血凝試驗、中和試驗、熒光抗體技術(shù)和ELISA等[1～3]。對于比較常用的免疫擴散試驗，由于沉淀抗體僅能在感染后的較短時間內(nèi)測出，所以采血時間不當會影響檢測結(jié)果。然而ELISA具有特異、靈敏、穩(wěn)定、快速等優(yōu)點，被越來越多地用于雞痘病毒抗體的檢測[4]。

1 材料和方法

1.1 病毒和血清

FPV282E4株，雞痘陽性血清為使用市場疫苗免疫SPF雞制備，陰性血清為1日齡SPF雞血清，待檢血清日常檢測樣品，新城疫、禽流感陽性血清為使用市場新城疫疫苗、禽流感單價疫苗免疫SPF雞制備。

1.2 其他材料

鄰苯二胺（OPD）、羊抗雞IgG-HRP，犢牛血清，96孔酶標板，SPF雞胚等。

1.3 抗原的擴增及提純

取9～10日齡SPF雞胚按常規(guī)方法制作CEF，長成單層后接種FPV，病變達80 %以上時收獲細胞；4℃2 000 r/min離心20min，沉淀重懸于PBS中；超聲波（60 W）裂解8個循環(huán)，每次15 s，冰浴45 s，36 %（W/V）蔗糖墊底，4℃15 000 r/min離心120 min，沉淀經(jīng)超聲波再次裂解4個循環(huán)；置20 %～50 %（W/V）蔗糖梯度上，4℃15 000 r/min離心90min，小心吸取病毒帶，0.1 %的甲醛滅活后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 間接ELISA試驗最佳條件選擇

1.4.1 抗原包被和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)的測定

以pH9.6的碳酸鹽緩沖液將抗原1∶100倍比稀釋至1∶12800，4℃24 h包被；然后用含0.05 %吐溫80的0.05mol/LPBS（簡稱PBST，pH為7.2）洗5 min×3次，加入含10 %犢牛血清（FCS）的PBS，150μl/孔，37℃1 h封閉；PBST洗5 min×3次，將陽性血清分別1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋，100μl/孔，37℃2 h進行方陣試驗；再用PBST洗5min×3次，每孔加1∶10 000稀釋的酶標抗體100μl/孔，37℃2 h；PBST洗5 min×3次，加入OPD底物溶液100μl/孔，37℃10 min；用2 M的H2SO450μl/孔進行終止后酶標儀OD490讀數(shù)，每個稀釋度重復(fù)一次，取其平均值。

1.4.2 酶標抗體工作濃度的選擇

待檢血清按1.4. 2確定的時間作用后，將酶標抗體分1∶10 000、1∶15 000和1∶20 000稀釋，100μl/孔，其它步驟同1.4.2相同。

1.4.3 底物最佳顯色時間的選擇

酶標抗體作用、洗滌、加入底物后，37℃分別作用5 min、10min、15min，用2M的H2SO450μl/孔終止后讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 抗原包被和待檢血清最適稀釋倍數(shù)的測定

方陣試驗如表1所示，隨著抗原、血清稀釋倍數(shù)的增大，其OD值逐步減小?？乖♂尡稊?shù)的逐漸變大，陽性、陰性血清的OD值逐漸降低，但P/N值逐漸變大。隨著抗原稀釋倍數(shù)的繼續(xù)增大，由于陽性O(shè)D值變化加快，而陰性O(shè)D值變化不太明顯，P/N值又逐漸變小。當抗原以1∶1 600、待檢血清以1∶100稀釋時，OD值為0.997，約等于1，陰性O(shè)D值為0.067，遠小于0.1，P/N值最大為13.9；同時，確定抗原1∶1600稀釋，待檢血清1：100稀釋。

2.2 酶標抗體稀釋濃度的選擇

當酶標抗體1∶15 000稀釋時，陽性O(shè)D值稍微降低，但P/N值最高，所以酶標抗體最佳工作濃度為1∶15 000。

2.3 顯色時間的選擇

當顯色時間10 min時，P/N最高，當顯色時間為15 min時，OD值升高，但陰性值升高，P/N反而降低，所以顯色時間以10 min為佳。

2.4 特異性試驗

間接ELISA檢測結(jié)果顯示本抗原與其它幾種血清無交叉反應(yīng)。

2.5 臨床樣品檢測

對50份雞血清檢測結(jié)果如表1所示，隨著免疫后日齡增加，其陽性率逐漸升高，陽性率在免疫后18 d最高，達到100 %，樣品總陽性率為82%。

表1 臨床血清樣品的間接ELISA檢測

3 討論

Buscaglia和Tripath等用中和試驗和間接ELISA同時進行檢測，結(jié)果中和試驗陽性檢出率很低，但用ELISA方法卻能明顯檢測出雞痘抗體的存在，證實了間接ELISA方法的靈敏性，此外，中和試驗、熒光抗體免疫技術(shù)因穩(wěn)定性差、操作麻煩及儀器昂貴而難以廣泛應(yīng)用。而ELISA則以其特異、敏感、快速、準確、操作簡便的特點，被越來越多地用于雞痘抗體的檢測。在ELISA試驗反應(yīng)中抗原抗體之間的免疫學(xué)反應(yīng)要經(jīng)過一定時間后才會進行充分，而酶的催化反應(yīng)與時間關(guān)系更大，這樣既能避免因反應(yīng)時間過短而引起的結(jié)果誤差，又不會因反應(yīng)過長影響檢測的敏感性和特異性，針對情況本試驗對每一步反應(yīng)時間都進行了最佳選擇。其最佳反應(yīng)條件為：抗原最佳稀釋度為1：1600，37℃1 h進行包被，用含有10 % FCS的PBS 37℃3h進行封閉；待檢血清1∶100稀釋，37℃作用1.5 h；酶標抗體1∶15 000稀釋，37℃作用1h；顯色為37℃10min。雖然間接ELISA具有以上優(yōu)點，但它對條件要求高，其中病毒的增殖和抗原的純化是其中最為關(guān)鍵的步驟。

[1] Sawata A，KKume Y.Nakase.Hemagglutinin ofHaemophilus para-gallinarum serotype 2 organisms：Occurrence and immunologicproperties of hemaglutinin[J].American Journal of Veterinary Re-search，2004，（43）：1311-1314.

[2] 徐春厚，孫力，于春生，等.用ELISA檢測雞痘病毒抗體的研究[J].中國畜禽傳染病，2006，（4）：33-35.

[3] 蔣成侏.酶免疫測定法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1984：102-132.

黃卓文（1982-），男，工作單位：廣州市高級技工學(xué)校，獸醫(yī)助理講師，學(xué)士，研究方向：動物醫(yī)學(xué)。