楊顯超 吳秀娟 李凱航 王 建

(上海市動物疫病預防控制中心,上海 201103)

Luminex液相芯片技術(shù)在動物醫(yī)學領(lǐng)域中的應用展望

楊顯超 吳秀娟 李凱航 王 建*

(上海市動物疫病預防控制中心,上海 201103)

液相芯片技術(shù)是以100種熒光編碼微球做為生物探針的載體,生物分子在懸浮液態(tài)體系中進行反應,以流式細胞術(shù)做為光學檢測手段的一種新型生物芯片技術(shù)。它以其易于操作、高通量、高靈敏度、高準確度、高精密度以及寬的線性測定范圍等優(yōu)點,目前已廣泛應用于生物醫(yī)學研究的各個領(lǐng)域,本文就液相芯片技術(shù)在動物醫(yī)學領(lǐng)域中的應用作一展望。

液相芯片；獸醫(yī)；檢測；應用

目前動物疫病和人畜共患病多病原協(xié)同感染的臨床現(xiàn)象越來越普遍，這給疫病的診斷提出了更高要求，單病原診斷技術(shù)已經(jīng)無法滿足臨床的需要，高通量、針對有共性的特定病原的鑒別診斷才能保證診斷的可靠性和準確性。特別是在出現(xiàn)類似黃浦江漂浮死豬事件和人感染H7N9禽流感疫情的公共衛(wèi)生事件和疫苗免疫效果評估時，動物疫控實驗室對高通量、高速度、多功能性、靈敏度高、準確性高的多重數(shù)據(jù)獲取和分析平臺需求尤為迫切。而液相芯片系統(tǒng)有機地整和了熒光編碼微球技術(shù)、激光分析技術(shù)、流式細胞技術(shù)、信號處理技術(shù)等多項技術(shù)，具有高通量、高速度、準確性高、重復性好、靈敏度高等優(yōu)點，既可用于臨床流行病診斷、監(jiān)測、疫苗免疫效果評估，也可用于基因表達、SNP分型、細胞因子檢測等科研領(lǐng)域，尤其是對于多種病原的診斷和篩選具有極大優(yōu)勢。該技術(shù)獲得2005年度國際臨床診斷技術(shù)革新大獎，代表著生命科學基礎(chǔ)研究和醫(yī)學診斷技術(shù)的發(fā)展方向，在國際臨床診斷技術(shù)領(lǐng)域的領(lǐng)軍地位得到了最具權(quán)威的認可。

1 液相芯片技術(shù)的原理

1997年由美國Luminex公司開發(fā)出了xMAP的檢測技術(shù)，標志著液相芯片技術(shù)的誕生。液相芯片體系由許多大小均一的圓形微球（直徑5.5～5.6μm）為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種微球上固定有不同的探針分子，將這些微球懸浮于一個液相體系中，就構(gòu)成了一個液相芯片系統(tǒng)，利用這個系統(tǒng)可以對同一個樣品中的多種不同分子同時進行檢測。在液相系統(tǒng)中，為了區(qū)分不同的探針，每一種固定有探針的微球都有一個獨特的色彩編號，或稱熒光編碼。在微球制造過程中摻人了紅色和橙色兩種熒光染料（這兩種染料各有10種不同區(qū)分），從而把微球分為100種不同的顏色，形成一個具有獨特光譜地址的含有100種不同微球的陣列。不同顏色微球在分類激光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光互不相同，這種分類熒光是識別不同微球的唯一途徑。利用這100種微球，可以分別標記上100種不同的探針分子。檢測時先后加人樣品和報告分子與標記微球反應，樣品中的目的分子（待檢測的抗原或抗體、生物素標記的靶核酸片段、酶等）能夠與探針和報告分子特異性結(jié)合，使交聯(lián)探針的微球攜帶上報告分子藻紅蛋白，隨后利用儀器（如Luminex100）對微球進行檢測和結(jié)果分析。儀器采用微流技術(shù)使微球快速單列通過檢測通道，并使用紅色和綠色兩種激光分別對單個微球上的分類熒光和報告分子上的報告熒光進行檢測。紅色激光可將微球分類，從而鑒定各個不同的反應類型（即定性）；綠色激光可確定微球上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量（即定量）。因此，通過紅綠雙色激光的同時檢測，完成對反應的實時、定性和定量分析。

原理圖：

2 液相芯片技術(shù)的優(yōu)點

液相芯片技術(shù)最突出的優(yōu)點在于：僅需少量樣本即可同時定性、定量檢測同一樣本中的多種不同目的分子，即多重檢測。具體說來，與現(xiàn)有用于臨床診斷的化學發(fā)光、電化學化光法及ELISA法相比，液相芯片技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點。

2.1 高通量

可對同一樣本中的多種不同目的分子同時進行實時、定性、定量分析。從理論上說，如果不存在交叉反應，檢測的通量等于微球的種類數(shù)，目前最多可達到100種。這與傳統(tǒng)方法的逐個檢測相比是一個質(zhì)的飛躍。

2.2 樣本用量少

由于在同一個反應孔中可以同時完成100種不同的生物學反應，所以大大節(jié)省了樣本用量，液相芯片的血清用量較ELISA法、化學發(fā)光法、電化學發(fā)光法要少得多。

2.3 操作簡單、快速

由于是基于液相反應動力學，因此反應速度快，孵育時間比傳統(tǒng)的固相檢測短。進行免疫學分析時，若使用高親和力抗體，2～3h內(nèi)即完成檢測，而核酸雜交分析在PCR擴增后lh 內(nèi)可得到結(jié)果。

2.4 靈敏度高

微球表面積大，每個微球上可包被10萬個捕獲抗體，如此高密度的捕獲抗體保證了能夠最大程度地與樣本中的抗原分子結(jié)合，提高檢測靈敏度。最低檢測濃度可達到0.lp/ml，是ELISA靈敏度的10～100倍。

2.5 檢測范圍廣

可達3-5個數(shù)量級（如Bio-Rad公司細胞因子檢測試劑盒的檢測范圍達到可達到0.2～ 32000 pg/ml）。

2.6 特異性強

無需洗滌就能夠自行將和微球結(jié)合的與未結(jié)合的分子區(qū)分開來，只讀取單個微球上的熒光信號，信噪比好。

2.7 準確性高

微球上的報告分子熒光強度與結(jié)合的待測分子成正比。由于液相芯片技術(shù)的檢測范圍大，因此不需要象ELISA檢測中那樣需將樣本多倍稀釋，從而減小了誤差。

2.8 重復性好

這是由于：與ELISA依靠酶放大作用的比色讀數(shù)相比，液相芯片技術(shù)中的熒光讀值更加直接、穩(wěn)定、靈敏；每種微球檢測100個，最終取熒光強度的中值作為結(jié)果，這相當于對每個樣本重復檢測了100次，而ELISA僅為雙復孔或三復孔，因此液相芯片檢測結(jié)果的準確性和重復性是ELISA無法比擬的。

2.9 費用低

同時檢測一個樣本中的多項指標可節(jié)約時間、樣本、試劑、耗材和勞動（比ELISA法低10～100倍），降低檢測成本，同時還提高了分析效率，僅需少量樣本即可獲得大量信息。

2.10 靈活

適用于各種蛋白質(zhì)和核酸的分析。商品化試劑盒的使用者只需增減探針交聯(lián)微球和標記分子即可滿足不同檢測項目的需要。

3 液相芯片的不足

在蛋白分析過程中，由于部分血清中含有異嗜性抗體，可與微球或捕獲抗體直接連接，從而形成非特異性的背景值，給實驗造成嚴重干擾，這種效應類似于在免疫測定中由異嗜性抗體導致的干擾[1]。血清預先與聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、proprietary試劑培育，可以有效的減少非特異性的背景信號的產(chǎn)生，但是proprietary 試劑在減少背景信號的同時也減少特異性信號的產(chǎn)生[2]。應用luminex的SeroMap 微球僅能部分的解決這些問題。在核酸檢測時要設(shè)計好偶聯(lián)探針，保證其特異性。液相芯片是一個開放的技術(shù)平臺，在進行多重PCR時，應注意防止PCR 產(chǎn)物污染實驗室。

4 液相芯片技術(shù)的應用進展

液相芯片是繼平面芯片之后的一種新型芯片技術(shù)，是一種非常靈活的多元分析平臺，在核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的大規(guī)模分析中具有巨大的應用潛力，可用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體-配體識別分析等眾多領(lǐng)域的研究，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用分析等都可以在同一個平臺上實現(xiàn)。鑒于液相芯片技術(shù)在高通量定性和定量檢測上令人矚目的優(yōu)勢，目前它在基因組學研究、蛋白質(zhì)組學研究、藥物開發(fā)、基礎(chǔ)研究和臨床診斷等方面的應用十分廣泛，近幾年來以此為平臺的產(chǎn)品開發(fā)和應用十分活躍，研究者既可以根據(jù)研究需要自行制備探針交聯(lián)微球，建立反應體系，也可使用種類繁多的商品化試劑盒進行分析。大體說來，液相芯片技術(shù)的應用包括兩大部分：液相蛋白芯片和液相基因芯片，前者主要是基于抗原一抗體反應，而后者實質(zhì)為核酸雜交?，F(xiàn)將液相芯片技術(shù)在動物醫(yī)學方面的應用展望如下：

4.1 動物細菌性傳染病的檢測

近年來應用液相芯片技術(shù)進行細菌性傳染病病原體檢測的研究日漸增多，涉及大腸桿菌、志賀氏菌、沙門菌、李斯特菌、空腸彎曲菌、葡萄球菌、霍亂弧菌、嗜肺軍團菌、肉毒梭菌、腦膜炎奈瑟菌。

大腸桿菌、沙門菌、李斯特菌和空腸彎曲菌是食源性疾病常見的細菌性病原體，臨床常規(guī)的檢驗方法包括培養(yǎng)、生化檢測、酶標法和核酸擴增等，費時費力，且需要多次檢測才可以明確所有的病原體。呂東月等[3]采用xMAP液相懸浮芯片檢測方法，建立一管同時檢測金黃色葡萄球菌、沙門菌、副溶血弧菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7、創(chuàng)傷弧菌和空腸彎曲菌的快速篩查方法。Dunbar SA 等[4]利用液相芯片技術(shù)完成對食源性疾病常見細菌病原體的多通道定量檢測。Zhao J等[5]將液相芯片與多重PCR結(jié)合，快速篩檢樣品中志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、嗜肺軍團菌和肉毒梭菌等10株致病菌。邱楊等[6]建立沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌等5種致病菌的快速液相芯片檢測方法。

4.2 動物病毒性傳染病的檢測

液相蛋白芯片技術(shù)還可應用于動物疾病的檢測診斷，如禽流感、口蹄疫等。張曉娜[7]成功地建立了檢測AIVH5、H7、H9、 NDV、IBV和ILTV 6種病毒核酸的單重液相芯片和多重液相芯片的方法，為禽呼吸系統(tǒng)病毒性疾病的快速、高通量鑒別診斷搭建了新的技術(shù)平臺，也為檢測其他病毒性疾病病原的研究提供了新的思路；朱向博[8]研究成功構(gòu)建了同時檢測 PPV、PCV2、PRRSV、CSFV 的四重液相芯片快速檢測方法，為豬病的快速高通量鑒別診斷搭建新技術(shù)平臺，也為液相芯片技術(shù)在動物多病毒快速高通量檢測、鑒別診斷等應用方面奠定了基礎(chǔ)；劉志玲[9]等應用液相芯片技術(shù)原理，以原核表達的重組牛白血病病毒gp51蛋白為抗原，建立了檢測牛白血病病毒抗體的Liquchip液相蛋白芯片檢測方法。

5 液相芯片的應用展望

液相芯片技術(shù)出現(xiàn)于以功能基因組學和蛋白質(zhì)組學為核心的后基因組時代，從20世紀末發(fā)明至今僅十余年時間，卻已經(jīng)應用于生命科學研究中的諸多領(lǐng)域。當然，液相芯片技術(shù)在動物疾病診斷檢測領(lǐng)域的應用也將會更加的寬泛。該技術(shù)可同時檢測多種目的物，而且對同一樣本可同時檢測不同的指標，達到多重檢測的目的。在進出口動物檢疫中，對幾種常檢、必檢的動物傳染病檢疫可一次完成，并且檢測樣本需要量少，對活檢動物無多大影響。在動物食品的獸藥殘留上，可對多種不同的獸藥進行同時檢測，可大大提高檢測效率，滿足口岸檢疫中快速檢驗的要求。待該技術(shù)發(fā)展成熟時，對動物病毒類傳染病、細菌類傳染病甚至是病毒與細菌混合感染的傳染病都可同時進行檢測，迅速作出診斷，可為重特大類動物疾病預警的快速反應機制提供參考數(shù)據(jù)。因此，在動物疾病診斷領(lǐng)域，液相蛋白芯片將會有更加廣闊的應用前景。

[1] Martins TB，Pasi BM，Litwin CM，et al. Heterophile antibody interferencein a multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for quantitation of cytokines in human serum[J]. Clin Diagn Lab Immunol，2004，（11）：325-328．

[2] Waterboer T，Sehr P，Pawlita M.Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays[J]. J Immunol Methods，2006，309（1-2）：200-204.

[3] 呂東月，曉路，陳妙齡，等.常見7 種食源性致病菌xMAP液相芯片快速篩查方法的建立及應用[J].衛(wèi)生研究，2012，41（1）：96-101．

[4] Dunbar SA，Vander Zee CA，Oliver KG，et al. Quantitative，multiplexed detection of bacterial pathogens：DNA and proteinapplications of the Luminex LabMAP system[J]. J MicrobiolMethods，2003，53（2）：245-252.

[5] ZHAO J，KANG L，HU R，et al. Rapid oligonucleotide suspension array-based multiplex detection of bacterial pathogens[J].Foodborne Pathog Dis，2013，10（10）：896-903.

[6] 邱楊，肖性龍，吳暉等.五種致病菌流式液相芯片檢測方法的建立[J]. 現(xiàn)代食品科技，2010，26（8）：889-893，909.Methods，2003，53（2）：245-252.

[7] 張曉娜.AIV，NDV，IBV和ILTV液相檢測芯片方法的建立[D].南京農(nóng)業(yè)大學，2012.

[8] 朱向博.四種豬病病原的液相芯片檢測方法的建立[D].西北農(nóng)林科技大學，2012.

[9] 劉志玲，陳茹，舒鼎銘，等.牛地方流行性白血病液相蛋白芯片檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學，2012，42（1）：26-30.

上海市市級農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計劃（滬農(nóng)青字（2014）第2-11號）