沈 凱 袁國裕 陳士良

血管緊張素II有效抑制大鼠高血壓模型血管過氧化氫酶表達(dá)的實驗研究

沈 凱 袁國裕 陳士良

目的探討血管緊張素II（AngII）對大鼠血管過氧化氫酶（CAT）表達(dá)的影響。方法利用AngII微泵灌注制備高血壓大鼠模型，分為AngII組、生理鹽水組、對照組，每組6只。分別檢測0、3、7、14d后各組大鼠尾動脈收縮壓；連續(xù)灌注14d后，取材觀察各組大鼠血管形態(tài)學(xué)改變；并采用免疫組化法檢測各組大鼠頸動脈血管中CAT及氧化應(yīng)激產(chǎn)物4-羥烯酸（4HNE）蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果與生理鹽水組及對照組相比，AngII灌注后能夠顯著提高大鼠尾動脈收縮壓水平及頸動脈血管中膜厚度（均P＜0.01）；免疫組化顯示AngII組頸動脈血管CAT表達(dá)顯著降低，而4HNE表達(dá)顯著增加（均P＜0.01）。結(jié)論Ang II可下調(diào)大鼠血管中CAT表達(dá)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。

高血壓；血管緊張素II；過氧化氫酶

高血壓病近年來已成為危害人類健康的主要疾病之一。血管重塑是高血壓病的一種顯著病理特征，也是導(dǎo)致高血壓機(jī)體并發(fā)癥如動脈粥樣硬化、腦卒中及心、腎功能衰竭的主要原因之一[1-2]。病理狀態(tài)下血管外膜可產(chǎn)生大量活性氧（ROS），通過自分泌、旁分泌作用參與血管重塑的發(fā)生。過氧化氫酶（CAT）是一種重要的抗氧化酶，其在清除ROS特別是H2O2時發(fā)揮著重要的作用，可以保護(hù)機(jī)體避免氧化應(yīng)激造成的損傷[3-4]。本文通過建立血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的大鼠高血壓模型，探討AngⅡ?qū)ρ芡饽ぶ蠧AT表達(dá)的作用，以期為高血壓血管重塑的防治提供新的線索。

1 對象和方法

1.1 對象和材料清潔級雄性SD大鼠（體重150～200g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供），AngⅡ（美國Sigma公司），Alzet滲透微泵（型號2002），Softron BP98A尾動脈血壓測量儀，山羊血清封閉液、免疫組織化學(xué)用載玻片（武漢博士德公司），DAB顯色試劑盒（福建邁新公司），4-羥烯酸（4HNE）一抗（美國Abcam公司），CAT一抗（美國Sigma公司），HRP標(biāo)記的二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及大鼠高血壓模型的建立雄性SD大鼠18只，運(yùn)用SPSS10.0軟件編程隨機(jī)分為3組，每組6只，即AngⅡ組[500ng/（kg·min）]、生理鹽水組（10μl/h）和對照組。各組大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，背部皮膚除毛，75%酒精棉球消毒，剪開皮膚。鈍性分離皮下組織，埋入預(yù)置AngⅡ或生理鹽水的微量泵，逐次縫合皮下及皮膚。連續(xù)灌注14d，分別在0、3、7、14d利用Softron BP98A尾動脈血壓測量儀測定未經(jīng)麻醉的、安靜狀態(tài)下的大鼠血壓。每次測量至少3次，取平均值。

1.2.2 大鼠頸動脈形態(tài)學(xué)檢測14d后，用10%水合氯醛腹腔麻醉各組大鼠，分離并剪下頸動脈，4%多聚甲醛4℃灌注固定過夜、石蠟包埋后行病理切片，HE染色，光鏡下檢測血管中膜厚度。

1.2.3 大鼠頸動脈CAT、4HNE免疫組化染色石臘組織切片經(jīng)干燥箱烤片2h后,常規(guī)予二甲苯、高濃度至低濃度乙醇脫臘至水，3%的H2O2封閉20min，以0.01M磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，以0.1M枸櫞酸鹽緩沖液熱抗原休復(fù)，0.01MPBS洗滌，山羊血清封閉20min。甩去封閉液，滴加一抗（CAT 1：100），4℃靜置過夜，切片自然復(fù)溫，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗切片3次，每次5min，滴加二抗（eGFP 1：200），室溫靜置60min，PBST洗3次，每次5min，滴加DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色，及時水洗終止顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，1%鹽酸酒精分化，自來水漂洗30min返藍(lán)，75%、95%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。每次設(shè)陰性對照，即以IgG代替一抗，其余步驟相同。4HNE免疫組化染色方法同CAT，一抗稀釋比例（4HNE1：100），二抗稀釋比例（PCNA 1：200）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的尾動脈收縮壓變化情況見表1。

表1 各組大鼠的尾動脈收縮壓變化情況（mmHg）

由表1可見，在灌注前（0d），各實驗組大鼠的尾動脈收縮壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在第3、7、14天AngⅡ組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

2.2 各組大鼠頸動脈厚度及形態(tài)學(xué)大鼠頸動脈中膜厚度為AngⅡ組（60.16±10.36）μm，生理鹽水組（41.16±6.73）μm，對照組（39.83±9.98）μm，與對照組及生理鹽水組相比，AngⅡ組頸動脈中膜增厚，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見插頁圖1。

2.3 各組大鼠頸動脈CAT、4HNE表達(dá)情況大鼠頸動脈CAT的表達(dá)為AngⅡ組0.16±0.03，生理鹽水組0.28±0.07，對照組0.26±0.05，4HNE的表達(dá)為AngⅡ組0.22±0.05，生理鹽水組0.15±0.03，對照組0.13±0.02，AngⅡ組CAT的表達(dá)較對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而4HNE的表達(dá)較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見插頁圖2、3。

3 討論

近年來，高血壓病的患病率呈逐年增高的趨勢，是危害人類健康的主要疾病之一。血管重塑伴隨高血壓血管疾病的始終，與高血壓形成互為因果。血管重塑是血管壁為適應(yīng)血管腔內(nèi)血流動力學(xué)環(huán)境變化而產(chǎn)生的病理生理現(xiàn)象,包括適應(yīng)性血管重塑和病理性血管重塑[5]。在病理狀態(tài)下血管外膜可產(chǎn)生大量活性氧，通過自分泌、旁分泌作用參與血管重塑的發(fā)生[6]。

CAT是一種重要的抗氧化酶，其在清除ROS特別是H2O2時發(fā)揮著重要的作用，可以保護(hù)機(jī)體避免氧化應(yīng)激造成的損傷。正常情況下，血管壁產(chǎn)生的ROS處于動態(tài)平衡，如果其大量產(chǎn)生或者清除受到抑制，可導(dǎo)致ROS大量蓄積，引起血管重塑的發(fā)生[7]。在病理狀態(tài)下，CAT表達(dá)及活性受到抑制時，機(jī)體的氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡就會遭到破壞，此時大量ROS蓄積就會導(dǎo)致病理性血管重塑的發(fā)生。因此，阻斷、控制ROS生成，或增加抗氧化物酶的表達(dá)和活性對控制血管重塑的發(fā)展具有重要的臨床意義[8]。

我們在前期的體外研究中已經(jīng)證實AngⅡ可下調(diào)血管外膜成纖維細(xì)胞內(nèi)CAT表達(dá)和活性，導(dǎo)致H2O2大量蓄積、細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，提示病理情況下血管外膜CAT缺陷可能是血管重塑發(fā)生的重要機(jī)制。抗氧化物酶CAT及其相關(guān)因素在血管外膜重塑的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用[9-10]。因此在本研究中我們著眼于抗氧化系統(tǒng)在AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓血管重塑中的作用，本研究證實了在AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓模型中，血管中抗氧化酶CAT表達(dá)顯著降低。這提示恢復(fù)抗氧化系統(tǒng)的表達(dá)能夠顯著改善AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓血管重塑。

綜上所述，我們的研究證實CAT參與了AngⅡ誘導(dǎo)的血管重塑過程，AngⅡ?qū)е碌难趸?抗氧化體系的失衡是導(dǎo)致血管重塑的重要原因，為高血壓及其并發(fā)癥的防治提供了新的理論思路和潛在的治療靶點(diǎn)。

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The effects of AngiotentionⅡon Catalase expression of rat vessels

SHEN Kai,YUAN Guoyu,CHEN Shiliang.Department of Cardiology,Zhoushan People′s Hospital,Zhoushan316000,China

SHEN Kai,E-mail:sk-555@163.com

Objective To investigate the effects of Angiotensin(Ang)Ⅱon the expression of catalase of rat vessels. Methods18 rats were randomly divided into Ang II group(n=6)infused with Ang II by micro-pump and saline group (n=6)infused with saline for 14 days,and control group(n=6).Systolic pressure of tail artery was measured at 0,3,7 and 14 day.The rats were sacrificed for observing vessel morphological changes at 14th day.Catalase and oxidative stress product-4HNE were determined by immunohistochemistry.Results Systolic blood pressure of tail artery as well as the thickness of carotid artery media increased significantly,Catalase was significantly lower while oxidative stress product-4HNE was higher in Ang II group compared to control group(all P＜0.01).Conclusion Ang Ⅱ may promote oxidative stress through inhibiting catalase expression of rat vessels.

Hypertension;AngiotentionⅡ;Catalase

2013-08-29）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃（項目編號：2011KYA170）

316000浙江省舟山醫(yī)院心內(nèi)科

沈凱，E-mail:sk-555@163.com