程俊華 洪 俊 鄭 程 陳學(xué)思 陳星星 趙景琳 李 進(jìn) 林加鋒

右心室心尖部起搏對(duì)Beagle犬心室肌ERK1/2磷酸化水平的影響

程俊華 洪 俊 鄭 程 陳學(xué)思 陳星星 趙景琳 李 進(jìn) 林加鋒

目的探討右心室心尖部起搏對(duì)Beagle犬心室肌電重構(gòu)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2磷酸化水平的影響。方法成年雄性Beagle犬12只，年齡3～4年，體重20～24kg，隨機(jī)分為對(duì)照組（n=6）和起搏組（n=6），均植入DDD起搏器后程控至關(guān)閉狀態(tài)，起搏組術(shù)后1周時(shí)開(kāi)啟起搏器并使心室起搏最大化。于術(shù)前及術(shù)后1周、4周關(guān)閉起搏器后行心電圖及超聲心動(dòng)描記術(shù)檢查，術(shù)后4周時(shí)處死動(dòng)物，觀察心肌病理結(jié)果，采用免疫印跡法檢測(cè)犬右心室心肌總ERK1/2及其磷酸化水平的變化。結(jié)果兩組心室肌病理及超聲心動(dòng)描記術(shù)、心率、QRS時(shí)間、總ERK1/2的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與對(duì)照組相比，術(shù)后4周時(shí)起搏組Tp-e間期、Q-T間期均增大，p-ERK增多（均P＜0.05）。結(jié)論右心室心尖部起搏可以導(dǎo)致心肌復(fù)極延長(zhǎng)及促進(jìn)心肌ERK1/2的磷酸化。

心室起搏；電重構(gòu)；ERK1/2磷酸化

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）是將胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核的重要通路之一。有研究表明，ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大和心室肥厚的重要因素[1]。起搏器在治療心力衰竭的同時(shí)，也可以引起心肌的解剖重構(gòu)和電重構(gòu)[2-3]，心肌的這種電重構(gòu)被認(rèn)為是致心律失常的重要基礎(chǔ)，也是心力衰竭惡化的重要機(jī)制。但心肌的電重構(gòu)與ERK1/2的磷酸化水平是否有關(guān)尚且未知。本研究擬評(píng)價(jià)右心室心尖部起搏對(duì)犬Tp-e間期、Q-T間期、QRS時(shí)間及射血分?jǐn)?shù)、心室腔大小、心室肌病理結(jié)果、B型腦鈉肽（BNP）及心肌ERK1/2水平的影響，從分子水平探討起搏引起心室電重構(gòu)的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品和儀器戊巴比妥鈉（批號(hào)：20110615，上海西塘生物科技有限公司），ERK1/2和p-ERK1/2的單克隆兔抗體（一抗，Cell Signaling，美國(guó)），CAPDH多克隆兔抗體（一抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（環(huán)亞生物科技有限公司），BNPELISA試劑盒（上海希美生物科技有限公司），起搏導(dǎo)線(xiàn)（Medtronic CaPSureFixm Novus 5076主動(dòng)導(dǎo)線(xiàn)，美國(guó)），永久性心臟起搏器（Medtronic SD303 DDD，美國(guó)），C型臂心血管造影機(jī)（西門(mén)子，德國(guó)），數(shù)字式十二道心電圖機(jī)（SE.1200 ExPress，深圳理邦精密儀器有限公司），起搏器程控儀（Medtronic 9790，美國(guó)），小動(dòng)物呼吸機(jī)（DW-3000，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康成年雄性Beagle犬12只,購(gòu)于南京亞?wèn)|實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[SCXK（蘇）2011．0013]。于溫州醫(yī)科大學(xué)普通動(dòng)物房不銹鋼籠單只飼養(yǎng)，室溫（20±5）℃，相對(duì)濕度55%±15%。采用隨機(jī)數(shù)字表法將12只Beagle犬分成兩組：對(duì)照組（n=6），體重（21.81±1.23）kg，始終關(guān)閉起搏器；起搏組（n=6），體重（21.43±1.48）kg，術(shù)后1周拆線(xiàn)并測(cè)量完電生理及解剖重構(gòu)指標(biāo)后開(kāi)啟起搏器，程控并縮短A-V間期至60ms,以保證右心室最大起搏率，持續(xù)起搏3周后關(guān)閉起搏器。

1.3 方法

1.3.1 DDD起搏器的植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，禁水4h。3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，約半小時(shí)后達(dá)松口指征，必要時(shí)術(shù)中追加麻醉。剃去犬前胸、頸下及四肢內(nèi)側(cè)毛發(fā)，清洗消毒上述部位。送入介入導(dǎo)管室，將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，行氣管插管,呼吸機(jī)輔助呼吸（SIMV模式，呼吸頻率20次/min，潮氣量10～20ml/kg，氧流量4～6L/ min，吸入氧濃度40%～60%。連接肢體導(dǎo)聯(lián)，描記體表12導(dǎo)聯(lián)心電圖。

頸部及前胸部皮膚常規(guī)消毒、鋪巾，Seldinger′s法穿刺右上腔靜脈,依次送入導(dǎo)引鋼絲、7F靜脈撕開(kāi)鞘及Medtronic CaPSureFixm Novus 5076主動(dòng)固定導(dǎo)線(xiàn)，在X線(xiàn)引導(dǎo)下將2根主動(dòng)固定導(dǎo)線(xiàn)分別經(jīng)上腔靜脈送至右心耳及右心室心尖部,在X線(xiàn)透視下穩(wěn)定導(dǎo)線(xiàn)頭端后旋出導(dǎo)線(xiàn)（一般旋出15～16圈），隨后撤出導(dǎo)絲，調(diào)整導(dǎo)線(xiàn)張力。導(dǎo)線(xiàn)參數(shù)檢測(cè)：要求心房、心室起搏閾值＜1.0V，R波振幅＞5.0mV，A波振幅＞2.0mV，兩者阻抗在400～1 000Ω。然后縫扎固定心房、心室主動(dòng)固定導(dǎo)線(xiàn)。制皮下隧道將心房、心室主動(dòng)固定導(dǎo)線(xiàn)引至開(kāi)胸部位，在其皮下制作囊袋,將起搏器與心房、心室主動(dòng)固定導(dǎo)線(xiàn)尾端連接并植入囊袋內(nèi)。測(cè)試起搏器起搏功能狀態(tài)，確定起搏功能狀態(tài)良好后關(guān)閉起搏器，縫合皮下組織及皮膚?；鼗\靜養(yǎng)。術(shù)后3 d內(nèi)每天肌肉注射青霉素160萬(wàn)U預(yù)防感染；7d內(nèi)每天換藥1次；術(shù)后1周時(shí)傷口愈合良好，無(wú)紅腫及流液，予以拆線(xiàn)。

1.3.2 電生理重塑及解剖重構(gòu)指標(biāo)的測(cè)定分別于術(shù)前、術(shù)后1周及術(shù)后4周時(shí)行超聲心動(dòng)描記術(shù)檢查，測(cè)量指標(biāo)包括：左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、舒張期室間隔厚度（IVSDd）、收縮期室間隔厚度（IVSSd）和左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），左心室短軸縮短率（FS），胸骨旁長(zhǎng)軸切面測(cè)量左心房前后徑（LAD）。行12導(dǎo)聯(lián)心電圖檢查測(cè)量QRS時(shí)間、Q-T間期及Tp-e間期。抽空腹血查血漿BNP濃度。術(shù)后1周測(cè)量完畢后開(kāi)啟起搏組起搏功能，程控起搏參數(shù)，縮短A-V間期至60ms，起搏模式VAT，以保證最大心室起搏率，術(shù)后4周時(shí)程控并關(guān)閉起搏器，然后重復(fù)測(cè)量上述指標(biāo)，測(cè)量完畢后處死動(dòng)物，迅速分離右心室心肌組織，一部分放入甲醛中保存做HE病理切片，一部分迅速放入液氮，轉(zhuǎn)入-80°冰箱備用。

1.3.3 ERK1/2及其磷酸化水平的測(cè)定取凍存的右心室心肌組織，加入組織裂解液，冰上勻漿，超聲破碎，4℃下12 000r/min離心15 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50μg蛋白上樣，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，電泳條件：恒壓，濃縮膠70V，分離膠120V。電泳結(jié)束后進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件：PVDF膜，恒流，電流300mA，冰上轉(zhuǎn)膜40min。印跡膜在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉2 h，TBST漂洗3次，每次10min，分別與ERK1/2、p-ERK1/2、GAPDH的一抗（1：1000）進(jìn)行雜交反應(yīng)，4℃過(guò)夜，TBST漂洗3次，每次10min。PVDF膜與HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1：5 000）室溫下?lián)u床雜交反應(yīng)2 h，再用TBST漂洗3次，每次10 min，加ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)2 min，采用AlhaimagerTM 2200圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，AlphaEase40軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，方差齊時(shí)兩組間比較采用Student′s t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本的比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組術(shù)后表現(xiàn)兩組Beagle犬術(shù)后均無(wú)感染、氣胸等并發(fā)癥、無(wú)厭食、氣促、精神萎靡，無(wú)胸腔積液、頸靜脈怒張等心力衰竭癥狀與體征。

2.2 兩組模型起搏前后心電圖、超聲心動(dòng)描記術(shù)指標(biāo)及BNP的變化見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，兩組術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后4周組內(nèi)和組間心率、QRS時(shí)間、超聲心動(dòng)描記術(shù)指標(biāo)、BNP等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；在Q-T間期及Tp-e間期方面，對(duì)照組術(shù)前、術(shù)后1周、4周及起搏組術(shù)前、術(shù)后1周之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），起搏組術(shù)后4周較術(shù)前、術(shù)后1周及對(duì)照組術(shù)后4周延長(zhǎng)（均P＜0.05）。

2.3 兩組模型總ERK1/2及其磷酸化水平比較見(jiàn)表2、圖1。

表1 兩組模型起搏前后心電圖、超聲心動(dòng)描記術(shù)指標(biāo)及BNP的變化

表2 術(shù)后4周時(shí)兩組p-ERK1/2、總ERK1/2的相對(duì)表達(dá)水平

圖1 術(shù)后4周時(shí)兩組p-ERK1/2、總ERK1/2、GAPDH蛋白的免疫印跡結(jié)果。

由表2、圖1可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，起搏組術(shù)后4周時(shí)右心室心肌表達(dá)的總ERK1/2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而p-ERK1/2水平明顯增高（P＜0.05）。

2.4 病理檢查結(jié)果兩組心肌組織排列整齊，均無(wú)心肌細(xì)胞的水腫、壞死、鈣化及心肌肥大和纖維化，無(wú)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，未發(fā)現(xiàn)心力衰竭細(xì)胞等病理改變。兩組術(shù)后4周的右心室心肌組織無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2。

3 討論

心臟電生理重構(gòu)是指由于激動(dòng)頻率和（或）激動(dòng)順序的變化導(dǎo)致心肌電生理特性的持續(xù)性改變[4]。這種改變主要表現(xiàn)在心肌復(fù)極時(shí)間延遲、動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)、有效不應(yīng)期離散度增加，以及心肌電生理異質(zhì)性增加。已有實(shí)驗(yàn)表明，跨室壁復(fù)極離散度的延長(zhǎng)是引起體表心電圖T波改變的決定性因素，而Tp-e間期（T波頂點(diǎn)至T波終點(diǎn)的時(shí)間）是反映復(fù)極離散度程度的重要指標(biāo)，對(duì)室性心律失常的預(yù)測(cè)和評(píng)估有重要價(jià)值[5]。

圖2 術(shù)后4周時(shí)兩組右心室心肌組織光學(xué)顯微鏡圖像（HE染色）。A.起搏組（×20），B.起搏組（×40），C.對(duì)照組（×20），D.對(duì)照組（×40）。

起搏器在心力衰竭治療中運(yùn)用廣泛，但是起搏器由于改變了生理起搏順序和收縮的不同步而導(dǎo)致心肌的電重構(gòu)和解剖重構(gòu)[3]。本研究通過(guò)改變心臟激動(dòng)順序，建立心室肌電重構(gòu)模型，然后測(cè)試電生理及解剖重構(gòu)指標(biāo)，此方法簡(jiǎn)便易行，模型穩(wěn)定。有研究表明，心室內(nèi)膜起搏1周可以產(chǎn)生穩(wěn)定的長(zhǎng)期記憶，然而心外膜起搏需要2～3周,但起搏時(shí)間足夠長(zhǎng)可由電重構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榻馄手貥?gòu)，因此本研究選擇起搏3周為時(shí)限。結(jié)果表明，兩組超聲心動(dòng)描記術(shù)指標(biāo)及病理切片無(wú)明顯差異，未發(fā)生解剖重構(gòu)，BNP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，未發(fā)生心功能不全，起搏組起搏3周后關(guān)閉起搏器測(cè)得心電圖Q-T間期、Tp-e間期較對(duì)照組延長(zhǎng)，表明右心室心尖部起搏3周產(chǎn)生了心肌的電重構(gòu)而未發(fā)生解剖重構(gòu)。本研究結(jié)果還表明心肌電重構(gòu)可以獨(dú)立于解剖重構(gòu)，并且可以領(lǐng)先于解剖重構(gòu)。

已有大量研究表明，ERK1/2磷酸化后才具有活性，心室肥厚和心肌細(xì)胞肥大與ERK1/2的激活有關(guān)[6]。另外，機(jī)械牽拉可以激活Na+/H+交換離子通道，進(jìn)而刺激細(xì)胞肥大基因的表達(dá)增加，使用特異性阻斷劑HOE649可以阻斷機(jī)械牽張引起的心肌細(xì)胞內(nèi)ERK的活化，說(shuō)明機(jī)械牽張可能通過(guò)激活Na+/H+交換的離子通道引起ERK1/2的活化。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，盡管心室起搏3周后，起搏組的心室肌ERK1/2無(wú)差異，但ERK1/ 2的磷酸化水平升高，進(jìn)一步提示ERK1/2的激活參與了心室肌電重構(gòu)的形成。另有研究表明，機(jī)械牽張可以激活心肌細(xì)胞ERK[7]。心肌細(xì)胞自身的機(jī)械牽張可改變細(xì)胞軸向的伸長(zhǎng)，促進(jìn)ERK的磷酸化，導(dǎo)致激活子蛋白1（AP1）和環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）的激活，從而促進(jìn)縫隙連接蛋白43的極化和表達(dá)[8]，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞之間的電傳導(dǎo)，這可能是心室起搏引起心肌電重構(gòu)的機(jī)制。

綜上所述，右心室心尖部起搏可以引起心室肌ERK1/2的磷酸化，可能是其產(chǎn)生心肌電重構(gòu)的分子機(jī)制。

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The effect of right ventricular apical pacing on ERK1/2 phosphorylation in Beagle myocardium

CHENG Junhua，HONG Jun,ZHENG Cheng,et al．Department of Cardiology,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou325000,China

LIN Jiafeng,E-mail:linjiafeng@medmail.com.cn

Objective To investigate the effects of right ventricular apical pacing on electrical remodeling and ERK1/2 phosphorylation in beagle myocardium.Methods12 male beagles,3-4 years old,underwent DDD pacemaker implantation and were randomly divided into two groups(n=6).The pacemakers were turned on and programmed to ensure ventricular pacing 1 week after implantation in pacing group and turned off all the time in control group.The ECG and UCG were recorded before,1 and 4 weeks after procedure with the pacemaker turned off.The beagles were sacrificed 4 weeks after procedure and phosphorylated ERK1/2 of right ventricular myocardium was determined by Western blotting.Results There was no statistical difference in the expression of ERK1/2,heart rate,QRS duration,BNP,ventricular myocardial pathology and parameters of UCG between the two groups.Tpeak-Tend interval and QT duration were prolonged and the expression of phosphorylated ERK1/2 increased in pacing group compared with control group(P＜0.05)4 weeks after procedure.Conclusion Right ventricular apical pacing may induce myocardial repolarization prolongation and promote ERK1/2 phosphorylation of myocardium.

Ventricular pacing;Electrical remodeling;ERK1/2 phosphorylation

2014-02-25）

（本文編輯：馬雯娜）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：81070155）

325000溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科

林加鋒，E-mail：linjiafeng@medmail.com.cn