杭偉，宋騰飛，段文娟，王曉，耿巖玲，楊丙田，張欽德

（1．山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2．山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；

3．濟南三峰生物工程技術有限公司，山東 濟南 251400；4．山東中醫(yī)藥高等?？茖W校，山東煙臺264000）

高速逆流色譜分離純化波棱瓜子中化學成分

杭偉1，2，宋騰飛1，段文娟2，王曉2，耿巖玲2，楊丙田3，張欽德4*

（1．山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2．山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；

3．濟南三峰生物工程技術有限公司，山東 濟南 251400；4．山東中醫(yī)藥高等專科學校，山東煙臺264000）

采用高速逆流色譜對波棱瓜子乙酸乙酯提取物進行分離純化，以石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水（體積比2：6：3：5）為溶劑，上相為固定相，下相為流動相，流速2mL／min，轉速850 r／min，共分離得到2個高純度化合物，經過高效液相色譜檢測，純度均高于95%。該方法簡便、快速、節(jié)省溶劑，可以對波棱瓜子中的化學成分進行快速有效的分離純化。

高速逆流色譜；波棱瓜子；分離純化

波棱瓜子，為葫蘆科一年生攀緣草本植物波棱瓜（Herpetospermum pedunculosum（Ser．）C．B．Clarke）的干燥成熟種子［1］，主要分布于我國西藏、云南以及印度、尼泊爾等地。本品性寒、味苦，具有清熱解毒、去火降熱及柔肝的功效，是一種傳統(tǒng)常用藏藥材，現(xiàn)代醫(yī)學常用于治療黃疸型傳染性肝炎、膽囊炎、消化不良及赤巴病等［2］，目前國內外對藏藥波棱瓜子的化學成分研究相對較少。

高速逆流色譜法（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）是一種不需要固態(tài)載體的液－液分配色譜技術，具有操作簡便、可避免因不可逆吸附而引起的樣品損失等優(yōu)點，已被廣泛應用于天然產物的分離純化當中［3－4］。本文首次采用高速逆流色譜對波棱瓜子乙酸乙酯提取物進行分離純化，得到了2個純度大于95%的化合物，并采用質譜和核磁共振波譜法鑒定其結構，實現(xiàn)了對波棱瓜子中化學成分快速、有效的分離純化。

1 材料、儀器與試劑

材料：波棱瓜子在四川康定地區(qū)一帶收集，經四川中醫(yī)藥科學院方青茂研究員鑒定，為葫蘆科一年生攀緣草本植物波棱瓜的干燥成熟種子。

儀器：TBP泵、GS10A型高速逆流色譜儀、多層聚四氟乙烯螺旋管（直徑2.3 mm，分離體積230 mL，β值為0.5～0.8）、3057-11記錄儀、8823B-紫外檢測器；Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng)（配有光電二極管陣列檢測器（PDA），Agilent 1100 Series6320 ion-trap質譜儀；Varian INOVA-600核磁共振波譜儀。

試劑：逆流色譜用乙酸乙酯、石油醚、氯仿和甲醇均為分析純，所用水為純凈水；高效液相色譜用甲醇為色譜純，所用水為純凈水。

2 實驗方法

2.1 波棱瓜子乙酸乙酯提取物的制備

波棱瓜子藥材5 kg，粉碎后用石油醚回流提取3次，每次2 h，將提取液過濾、合并、減壓濃縮，得石油醚提取物234 g；殘渣繼續(xù)用乙酸乙酯回流提取3次，每次2 h，將提取液過濾、合并、減壓濃縮，得到乙酸乙酯提取物185 g。

2.2 HSCCC分離

2.2.1 溶劑體系的配制

本實驗溶劑體系為石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水（體積比2：6：3：5），配約1.5 L，置于分液漏斗中，振蕩使其完全混合后靜置分層，平衡后將上下兩相體系分開，上相作為固定相，下相作為流動相，分別超聲脫氣5～10 min，備用。稱取波棱瓜子乙酸乙酯提取物200 mg，加入上下相各5 m L，振蕩使其完全溶解，備用。

2.2.2 HSCCC制備分離過程

將溶劑體系中的上相（固定相）以20 mL／min的流速泵入HSCCC分離管內，待上相充滿分離管后，調至主機轉速為850 r／min，順時針旋轉，待轉速穩(wěn)定后，以2 mL／min流速泵入下相（流動相），檢測波長254 nm。當流動相從主機口流出時，體系達到流體動力學平衡，再將已準備好的樣品注入HSCCC儀器內，采集數(shù)據，根據圖譜收集目標成分。

2.2.3 分配系數(shù)（Kd）的測定

根據相關文獻報道的Kd值測定方法［5－6］，取波棱瓜子乙酸乙酯提取物樣品置于試管內，加入上下相各3 m L振蕩，使樣品完全溶解，靜置分層，各取上下相5μL，用高效液相色譜進行檢測，上相峰面積為A1，下相峰面積為A2，Kd＝A1／A2。

2.3 高效液相色譜條件

C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A：甲醇，流動相B：水；等度洗脫：0～30 min，60%A，40%B；流速：1 m L／min；檢測波長：255 nm；進樣量：5μL，柱溫：室溫。

3 結果與討論

3.1 HSCCC分離條件優(yōu)化

在高速逆流色譜法分離中，選擇溶劑體系是分離中的關鍵環(huán)節(jié)，溶劑體系是否合適是由該目標化合物在其中的分配系數(shù)Kd來衡量的，對于目標化合物適宜的溶劑系統(tǒng)分配系數(shù)應在0.5～2之間［7］。本實驗根據目標化合物的極性采用石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水體系，因為這個兩相體系具有較寬的極性范圍以及良好的溶解度。如表1所示，選擇了幾種不同的溶劑系統(tǒng)，進行Kd值測量。當采用體積比為2：6：5：3及2：6：4：4的溶劑體系時，會導致分離的時間短，達不到良好的分離效果，難以實現(xiàn)目標化合物的分離純化。采用體積比2：6：2：6的體系時，Kd值偏大，雖然取得了很好的分離效果，但是分離時間較長，分離效率低。實驗結果表明，當采用體積比為2：6：3：5的石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水體系時，目標化合物才能得到比較理想的分離效果，而且分離的時間較為合適。

表1 目標成分在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)Table 1 Kdof compounds in different solvent system

3.2 HSCCC分離純化結果

選擇石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水（體積比2：6：3：5）體系，按照2.2節(jié)所述的方法對波棱瓜子乙酸乙酯提取物進行HSCCC分離，根據HSCCC譜圖分別收集，結果如圖1所示。經過HPLC檢測，分別得到2個高純度化合物，經冷凍干燥，得化合物1為11.4 mg，化合物2為15.7mg。結果如圖2所示。

圖1 波棱瓜子乙酸乙酯提取物高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC chromatogram of Herpetospermum pedunculosum seeds ethyl acetate extract

圖2 波棱瓜子乙酸乙酯提取物及各化合物HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of extracts and individual compound from Herpetospermum pedunculosum seeds ethyl acetate extract

3.3 化合物結構鑒定

化合物1：ESI-MS（m／z）：551.6［M-H］-.1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.60（1H，dd，J＝8.4 Hz，1.8 Hz，H-6），7.57（1H，d，1.8 Hz，H-2），6.87（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），6.81（1H，dd，J＝8.4 Hz，1.8 Hz，H-6″），6.77（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5″），6.60（1H，d，J＝1.8 Hz，H-2″），6.19（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2′），5.69（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6′），5.20（1H，dd，J＝7.8 Hz，4.8 Hz，H-8），4.68（1H，d，J＝4.8 Hz，H-7），4.60（1H，d，J＝4.8 Hz，H-7′），4.20（3H，m，-OCH3），3.85（2H，m，CH2OH），3.48（2H，s，3-OCH3），3.03（1H，m，H-9′），2.97（1H，m，H-9″）.13C-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：199.08（C-7），150.58（C-4），146.96（C-3″），146.71（C-3），146.38（C-3′），145.22（C-4″），142.16（C-1″），132.85（C-1′），132.82（C-1），128.88（C-6），124.22（C-5′），122.27（C-6′），118.94（C-6″），118.09（C-5″），114.25（C-5），114.05（C-2），108.56（C-2″），107.51（C-2′），85.81（C-7′），85.69（C-7″），71.67（C-9′），71.57（C-9″），63.89（CH2OH），56.09（3-OCH3），55.96（3′-OCH3），55.94（3″-OCH3），54.18（C-8″），54.06（C-8′），47.87（C-8）.化合物1的ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR數(shù)據與文獻［8］報道基本一致，故鑒定化合物1為Herpetrione。

化合物2：ESI-MS（m／z）：301.3［M-H］-.1H-NMR（DMSO，600 MHz）δ：10.04（1H，brs，-OH），8.04（1H，s，H-1′），7.60（1H，s，4′），7.07（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），6.95（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），5.78（1H，t，J＝2.4 Hz，CH2OH），4.90（2H，d，J＝2.4 Hz，CH2OH），3.98（3H，s，2′-OCH3），3.85（3H，s，7-OCH3）；13C-NMR（DMSO，600 MHz）δ：160.49（C-2），159.24（C-7），154.25（C-2′），152.82（C-8a），147.05（C-3′），140.08（C-5），128.92（C-4），114.97（C-6），114.52（C-4′），113.61（C-3），111.05（C-4a），109.64（C-1′），101.34（C-8），63.78（CH2OH），56.15（2′-OCH3），56.04（7-OCH3）.化合物2的ESIMS、1H-NMR和13C-NMR數(shù)據與文獻［9］報道基本一致，故鑒定化合物2為Herpetolide A。

4 討論

本文首次采用高速逆流色譜法對波棱瓜子乙酸乙酯提取物進行分離純化，以石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水（體積比2：6：3：5）溶劑體系，分離得到2個化合物，其純度經高效液相色譜檢測均高于95%。該方法簡便、快速并節(jié)省溶劑，可以對波棱瓜子乙酸乙酯提取物進行快速有效的分離純化，具有較好的實用價值。波棱瓜子化學成分研究是進一步進行活性研究及產品開發(fā)的必要步驟，建立相關成分快速有效的分離純化方法，可以為波棱瓜子資源的開發(fā)應用提供技術支持。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會．中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準藏藥第一冊［M］．北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，1995：64．

［2］張梅，董小萍，王慧，等．藏藥波棱瓜子脂肪油成分的氣相色譜－質譜分析［J］．成都中醫(yī)藥大學學報，2004，27（4）：49－50．

［3］張?zhí)煊?，王曉．高速逆流色譜技術［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2011．

［4］FANG L，LIU YQ，YANG B，et al．Separation of alkaloids from herbs using high-speed counter-current chromatography［J］．Journal of Separation Science，2011，34（19），2545－2558．

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［7］ITO Y．Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography［J］．Journal of Chromatography A．2005，1065（2）145－168．

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Separation and purification of chem ical constituents in Herpetospermum pedunculosum seeds by high-speed counter-current chromatography

HANG Wei1，2，SONG Teng-fei1，DUAN W en-juan2，WANG Xiao2，GENG Yan-Iing2，YANG Bing-tian3，ZHANG Qin-de4*
（1．College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2．Shandong Analysis and Test Center，Jinan 250014，China；3．Three peak biological engineering technology Co．Ltd．，Jinan 250014，China；4．Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Yantai 264000，China）

We originally employed high speed counter-current chromatog raphy（HSCCC）to separate and purify chemical constituents in ethyl acetate dissolvedHerpetospermum pedunculosumseeds．We separated two high-purity chemical compounds with petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water（volume ratio of 2：6：3：5）as solvent，upper organic stationary phase and lower aqueous mobile phase，flow rate of 2 mL／min and rotation speed of 850 r／min．Their HPLC detected purities were more than 95%．The method is simple，rapid，solvent-saving and can rapidly and effectively separate and purify the chemical constituents inHerpetosperm um pedunculosumseeds．

high-speed counter-current chromatography；Herpetospermum pedunculosum seed；separation and purification

R284.2；O657.7

A

1002-4026（2014）01-0040-05

10.3976／j.issn.1002－4026.2014.01.007

2013-11-18

杭偉（1986－），碩士研究生，研究方向為中藥活性成分。

*通訊作者，張欽德，教授，研究方向為中藥質量控制與中藥資源研究。Email：zhangqinde0929＠163．com