王 沖，侯 娟，韓 晶，芮 菁

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津300070)

藏茵陳總萜酮致突變性及抗突變性研究*

王 沖，侯 娟，韓 晶，芮 菁

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津300070)

目的:研究藏茵陳總萜酮在不同劑量下的致突變及抗突變作用。方法:Ames實(shí)驗(yàn)采用預(yù)培養(yǎng)法，微核實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)灌胃給藥10 d的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核計(jì)數(shù)法。結(jié)果:致突變實(shí)驗(yàn)中，藏茵陳總萜酮在＜2 500 μg/皿和＜40 mg/kg劑量下，未誘發(fā)Ames實(shí)驗(yàn)各菌株回變菌落數(shù)和微核實(shí)驗(yàn)骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的增高。抗突變實(shí)驗(yàn)中，藏茵陳總萜酮在625～2 500 μg/皿濃度范圍內(nèi)，可使陽(yáng)性劑環(huán)磷酰胺和絲裂霉素C所誘發(fā)的高回變菌落數(shù)出現(xiàn)明顯降低;藏茵陳總萜酮在50～100 mg/kg劑量范圍，可使陽(yáng)性劑40 mg/kg環(huán)磷酰胺或2 mg/kg絲裂霉素C所誘發(fā)的高微核率出現(xiàn)明顯降低。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)條件下，藏茵陳總萜酮不存在基因突變和染色體畸變作用，且有顯著的抗突變作用。

藏茵陳總萜酮，致突變，抗突變

藏茵陳又名“蒂達(dá)”，系中華民族藥中瑰寶，青藏高原藏藥八珍之一，用于治療熱癥、肝膽病與血液病，療效顯著，藥用價(jià)值高［1］;另一方面，其植株生長(zhǎng)周期短，有效成分含量高，來(lái)源豐富，具有可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［2］。近年來(lái)，伴隨著民族醫(yī)藥的迅猛發(fā)展，國(guó)內(nèi)外已開(kāi)發(fā)出很多以藏茵陳為主要原料的治療藥物和保健用品，用于某些疾病的防治和保?。?］。現(xiàn)代分析表明，藏茵陳中主要活性成分為環(huán)烯醚萜、呫噸酮、三萜等化學(xué)成分［4］。本研究對(duì)藏茵陳總萜酮進(jìn)行了Ames實(shí)驗(yàn)及小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)，以了解受試物是否具有體內(nèi)、體外的致突變性和抗突變性，為藏茵陳的安全應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物藏茵陳總萜酮(TTKS)，黃色粉末狀，為龍膽科獐牙菜屬川西獐牙菜Swertia mussotii Franch提取物，天津藥物研究院田成旺研究員惠贈(zèng)，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)其中獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龍膽苦苷、芒果苷和當(dāng)歸醇苷的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.5%［5］。受試物以二甲基亞砜溶解為200 mg/ml，實(shí)驗(yàn)時(shí)以生理鹽水稀釋至相應(yīng)濃度。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)KM小鼠，軍科院衛(wèi)生環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(軍)2009－0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(津)2011－0007。小鼠維持飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(京)2009－0012。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。人工照明，12 h明/12 h暗。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于環(huán)境中適應(yīng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 菌株與試劑組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102菌株及大鼠肝微粒酶(S9)，購(gòu)自上海寶錄生物科技有限公司，MOLTOX公司產(chǎn)品，菌株經(jīng)特性鑒定合格后使用;S9mix用Cofactor－I，購(gòu)自オリエンタル酵母工業(yè)株式會(huì)社。陽(yáng)性對(duì)照物9－氨基吖啶(9－AA)、呋喃基糠酰胺(AF－2)、2－氨基芴(2－AAn)、環(huán)磷酰胺(CP)及絲裂霉素C(MMC)，Sigma公司產(chǎn)品。氯化鈉、氯化鉀、瓊脂等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 致突變實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 Ames實(shí)驗(yàn)［6］采用平板摻入法，用TA100菌株的非代謝活化系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)受試物5 000、2 500、1 250、625、312、156、78和39 μg/皿8個(gè)劑量組，每個(gè)劑量2個(gè)平行皿，37℃下培養(yǎng)48 h后，鏡下觀察平皿中細(xì)菌背景菌苔的多少或有無(wú)。結(jié)果在劑量2 500 μg/皿時(shí)，未出現(xiàn)明顯的抑菌現(xiàn)象，故正式實(shí)驗(yàn)最高劑量采用2500 μg/皿。正式實(shí)驗(yàn):選取TA97、TA98、TA100和TA102菌株，采用平板摻入法。受試物設(shè)5個(gè)劑量組，分別為2 500、1 250、625、312和156 μg/皿;同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，給予生理鹽水;溶劑對(duì)照組給予二甲基亞砜;陽(yáng)性對(duì)照組分別給予9－AA，AF－2，MMC及2－AAn。每個(gè)測(cè)試濃度設(shè)3個(gè)平行皿，在活化(+ S9)與非活化(－S9)條件下，37℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。計(jì)數(shù)每皿的回變菌落數(shù)，計(jì)算各組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差及各劑量組平均回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)的比值(mutation ratio，MR)。若MR＞2，且呈劑量－反應(yīng)關(guān)系者為陽(yáng)性結(jié)果。重復(fù)實(shí)驗(yàn)1次。

1.2.1.2 微核實(shí)驗(yàn)選取KM小鼠50只，雌雄各半，體重為22～24 g，隨機(jī)分為5組，每組10只。設(shè)受試物100、50和25 mg/kg 3個(gè)劑量組，及環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。小鼠按20 ml/kg灌胃，溶劑對(duì)照及各受試物組連續(xù)灌胃10 d，溶劑對(duì)照組給予等劑量生理鹽水，末次給予受試物后6 h，小鼠脫臼處死;陽(yáng)性對(duì)照組一次性腹腔給予環(huán)磷酰胺40 mg/kg，24 h后處死動(dòng)物。取股骨骨髓常規(guī)制片，甲醇固定，Giemsa染色。鏡檢嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1 000個(gè)，計(jì)算含微核的細(xì)胞數(shù)(MN)及微核細(xì)胞千分率，同時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與正紅細(xì)胞的比值(PCE/NCE)。

微核率(‰)=(含有微核的細(xì)胞數(shù)/嗜多染紅細(xì)胞數(shù))×1 000‰。

1.2.2 抗突變實(shí)驗(yàn)［7］

1.2.2.1 Ames實(shí)驗(yàn)選用TA100和TA102兩個(gè)菌株。將菌株、±S9混合液和陽(yáng)性劑(CP或MMC)三者均勻混合后，于37℃振蕩水浴培養(yǎng)箱中，預(yù)培養(yǎng)30 min后，再加入不同濃度的受試物及頂層培養(yǎng)基，混合均勻后倒碟，其他實(shí)驗(yàn)方法同致突變實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 微核實(shí)驗(yàn)選取KM小鼠90只，雌雄各半，體重為22～24 g，隨機(jī)均分為9組，其中受試物高、中、低劑量各2組(給予不同陽(yáng)性藥)，溶劑對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組。溶劑對(duì)照及受試物各劑量組連續(xù)灌胃給予10 d，溶劑對(duì)照組給予等劑量的生理鹽水。于動(dòng)物處死前24 h，除溶劑對(duì)照組外，各組均一次性腹腔注射給予致突變劑40 mg/kg CP或2 mg/kg MMC，末次給予受試物6 h后處死小鼠。常規(guī)取股骨骨髓，小牛血清稀釋后涂片，干燥，甲醇固定，Giemsa染色，每只小鼠于油鏡下計(jì)數(shù)1 000個(gè)PCE中出現(xiàn)的MN。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，骨髓微核率采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 致突變實(shí)驗(yàn)

2.1.1 Ames實(shí)驗(yàn)藏茵陳總萜酮各劑量組對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100及TA102誘發(fā)的回變菌落數(shù)見(jiàn)表1。在加與不加S9的條件下，各菌株陽(yáng)性對(duì)照組MR均大于2;而藏茵陳總萜酮各組的MR均小于2，與自發(fā)回變數(shù)相比，未見(jiàn)明顯增加，表明藏茵陳對(duì)鼠傷寒沙門氏菌無(wú)致突變作用。

2.1.2 微核實(shí)驗(yàn)藏茵陳總萜酮各劑量組對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響見(jiàn)表2。結(jié)果顯示:陽(yáng)性對(duì)照組微核細(xì)胞率為30.4‰，與溶劑對(duì)照組比較，具有極顯著性差異(P＜0.01)。藏茵陳總萜酮各劑量組微核細(xì)胞率均小于3‰，與溶劑對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

2.2 抗突變實(shí)驗(yàn)

2.2.1 Ames實(shí)驗(yàn)藏茵陳總萜酮各劑量組對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA100及TA102誘發(fā)的回變菌落數(shù)見(jiàn)表3。兩種菌株于不同的致突變劑［烷化劑－環(huán)磷酰胺(需代謝活化)，絲裂霉素(不需代謝活化)］作用下，可致菌株回變菌落數(shù)顯著增加，MR均大于2。藏茵陳總萜酮于625～2 500 μg/皿范圍內(nèi)，可降低兩種菌株回變菌落數(shù)，與相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照組比較，均有顯著性差異。表明藏茵陳總萜酮對(duì)陽(yáng)性誘變劑所誘導(dǎo)的Ames試驗(yàn)菌株的回復(fù)突變具有拮抗作用。重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次(數(shù)據(jù)未顯示)，兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2.2 微核實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性組和各劑量加陽(yáng)性試劑處理組所誘發(fā)的微核細(xì)胞率見(jiàn)表4。結(jié)果顯示:MMC、CP組的微核細(xì)胞率均有顯著升高，分別為33.5‰及28.9‰。動(dòng)物連續(xù)灌胃給予受試物3個(gè)劑量10 d，微核細(xì)胞率有明顯降低，并且伴隨著藏茵陳總萜酮?jiǎng)┝康脑黾佣鴾p少。藏茵陳總萜酮50、100 mg/kg劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，有顯著性差異。

表1 藏茵陳總萜酮Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(s)

表1 藏茵陳總萜酮Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(s)

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表2 藏茵陳總萜酮微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果(s)

表2 藏茵陳總萜酮微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果(s)

與陰性對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01

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表3 藏茵陳總萜酮的Ames實(shí)驗(yàn)抗突變結(jié)果(

表3 藏茵陳總萜酮的Ames實(shí)驗(yàn)抗突變結(jié)果(

與陽(yáng)性對(duì)照組相比，*P＜0.05;＊＊P＜0.01陽(yáng)性藥物:TA100:CP 200 μg/皿;TA102:MMC 2 μg/皿

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表4 藏茵陳總萜酮的微核試驗(yàn)抗突變結(jié)果(s)

表4 藏茵陳總萜酮的微核試驗(yàn)抗突變結(jié)果(s)

與陽(yáng)性對(duì)照組相比，*P＜0.05;＊＊P＜0.01

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3 討論

藏茵陳總萜酮為川西獐牙菜提取物，由環(huán)烯醚萜類、呫噸酮類、三萜類等多種成分構(gòu)成，具有廣泛的生物活性。環(huán)烯醚萜類主要包括獐牙菜苦苷、獐芽菜苷、龍膽苦苷等，具有抗炎、抗膽堿、修復(fù)肝損傷細(xì)胞、保護(hù)胃潰瘍、抗癌等藥理活性［8，9］;呫噸酮類包括芒果苷、當(dāng)藥醇苷、1－三羥基－3，3，4－三甲氧基呫噸酮等，具有抑制轉(zhuǎn)氨酶升高、抗乙肝病毒等廣泛的藥理活性［10］。相對(duì)于藏茵陳功效學(xué)的研究，其毒理方面的研究卻鮮有報(bào)道［11］。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)表明，藏茵陳主要活性成分——總萜酮在＜2 500 μg/皿和＜40 mg/kg劑量下，Ames實(shí)驗(yàn)和微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn)判定，可認(rèn)定該受試物為非遺傳毒物。

為進(jìn)一步檢測(cè)藏茵陳總萜酮是否具有抗突變的特性，本實(shí)驗(yàn)參考已有的文獻(xiàn)方法［7，12］，根據(jù)藥物抗突變的一般機(jī)理，設(shè)計(jì)了不同目的的抗突變性實(shí)驗(yàn)。其中，Ames實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以考查受試物是否具有促進(jìn)已突變細(xì)胞的DNA修復(fù)，減少DNA損傷數(shù)量為目的;小鼠微核實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以考查受試物是否具有保護(hù)未突變細(xì)胞免受損傷或減少細(xì)胞DNA損傷數(shù)量為目的。結(jié)果表明，藏茵陳既有促進(jìn)已突變細(xì)胞DNA修復(fù)的細(xì)胞內(nèi)抗突變作用，又可保護(hù)未突變細(xì)胞免受損傷，對(duì)致突變物有一定的滅活作用。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，藏茵陳總萜酮未引起Ames實(shí)驗(yàn)菌株回復(fù)突變數(shù)及小鼠骨髓微核率增加，提示藏茵陳總萜酮無(wú)致突變性。另一方面，藏茵陳總萜酮可拮抗由CP及MMC引起的突變作用，提示藏茵陳總萜酮具有抗突變性。

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3汪海英.八味獐牙菜散加減治療慢性膽囊炎80例［J］.浙江中醫(yī)雜志，2009，44(7):537

4馬麗娜，張鐵軍，田成旺，等.大孔樹(shù)脂分離純化川西獐牙菜中環(huán)烯醚萜苷類和口山酮類成分的工藝研究［J］.中草藥，2010，41(2):227

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11黃仁勇.口服藏茵陳片出現(xiàn)男子性功能障礙1例［J］.藥物流行病學(xué)雜志，2000，9(1):45

12王明臣，張善鋒，毛麗紅，等.Ames實(shí)驗(yàn)對(duì)葉黃素的致突變性及抗突變性研究［J］.癌變·畸變·突變，2006，18(1):65

Studies on the safety and anti－mutagenicity of total terpene ketones form Swertia mussotii

Wang Chong，Hou Juan，Han Jing，Rui Jing
(Tianjin Institute for Drug Control，Tianjin 300070)

Objective:To study the mutagenic and anti－mutagenic activity of total terpene ketones from Swertia mussotii (TTKS)under different doses.Methods:The studies were conducted with Ames test of preceding incubate and micronucleus test in mouse which was administrated gavage once a day for a consecutive 10 d.Results:In mutagenic test，TTKS at a dose lower than 2000 μg/plate induced neither remarkable nor dose－dependent increase mutagenicity of the four strains and at a dose lower than 100 mg/kg did not increase the micronucleus frequencies of polychromatic erythrocytes.In anti－mutagenic test，comparing with the positive groups of CP and MMC，TTKS at 625～2500 μg/plate could decrease the colony numbers in T100and T102strains; TTKS at 50～100 mg/kg could significantly reduced the rate of micronucleus frequencies polychromatic erythrocytes in bone marrow of mice induced by CP and MMC as compared with the positive control.Conclusion:Under our experimental conditions，TTKS has no effect of mutagenesis and processes significant anti－mutagenic properties.

total terpene ketones from Swertia mussotii，mutagenicity，anti－mutagenicity

R965

A

1006-5687(2014)01-0017-04

2013-10-09