趙江萍，陳海龍，王鳳鳴

（1.北京軍區(qū)聯(lián)勤部門診部，北京 100042；2.北京軍區(qū)聯(lián)勤部第六分部門診部；3.江蘇省常州市疾病預(yù)防控制中心）

2型糖尿病患者外周血中膜型及可溶性CD28分子的表達(dá)及意義

趙江萍1，陳海龍2，王鳳鳴3

（1.北京軍區(qū)聯(lián)勤部門診部，北京 100042；2.北京軍區(qū)聯(lián)勤部第六分部門診部；3.江蘇省常州市疾病預(yù)防控制中心）

目的分析2型糖尿病患者外周血中膜型及可溶性CD28分子的表達(dá)及其意義。方法分別收集2012年12月至2013年12月在北京軍區(qū)聯(lián)勤部門診部就診的30例2型糖尿病患者（糖尿病組）及同期30名健康體檢者（對(duì)照組）的外周血，通過溶血及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其外周血T細(xì)胞表面CD28分子的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)血清中可溶性CD28的水平，并進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果糖尿病組外周血CD4＋CD28＋T細(xì)胞和CD8＋CD28＋T細(xì)胞顯著低于對(duì)照組［（28.29±7.71）%比（32.77±4.28）%和（12.18± 3.17）%比（18.53±3.27）%，均P＜0.01］，血清中可溶性CD28水平顯著高于對(duì)照組［（2.86±0.96）比（0.61±0.19）μg／L，P＜0.01］。結(jié)論協(xié)同刺激分子CD28很可能參與了2型糖尿病的免疫病理機(jī)制。

糖尿病，2型；抗原，CD28；T淋巴細(xì)胞

2型糖尿病是一種自身免疫性的慢性炎癥性疾病，目前認(rèn)為免疫功能及免疫調(diào)節(jié)的異常在其發(fā)病及并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CD28是CD28／B7超家族的協(xié)同刺激分子，表達(dá)在人類95%的CD4＋T細(xì)胞及50%CD8＋T細(xì)胞表面，參與T細(xì)胞的活化、增殖、分化及發(fā)揮免疫效應(yīng)功能［1］，在老年免疫［2］、自身免疫［3］、腫瘤免疫［4］中的生物學(xué)作用均備受關(guān)注?，F(xiàn)就2型糖尿病患者外周血T細(xì)胞表面膜型CD28分子的表達(dá)及血清中可溶性CD28的水平進(jìn)行分析，探討該分子在2型糖尿病免疫病理機(jī)制中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年12月至2013年12月在北京軍區(qū)聯(lián)勤部門診部就診的2型糖尿病患者30例為糖尿病組，其中男16例，女14例，年齡41～70歲，平均年齡（53.0±10.2）歲；另選取同期健康體檢者30名為對(duì)照組，其中男16名，女14名，年齡年齡40～70歲，平均年齡（52.5±10.8）歲。所有2型糖尿病患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，病程1～6個(gè)月，均無其他自身免疫性疾病、腫瘤和感染性疾病等，半年內(nèi)均未使用過影響免疫功能的藥物。所有受試者均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 小鼠抗人單克隆抗體CD4-FITC、CD8-FITC、CD28-PE以及同型對(duì)照抗體IgG1-FITC、IgG1-PE（法國(guó)Immunotech公司）；溶血?jiǎng)绹?guó)Invitrogen公司）；可溶性CD28的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法檢測(cè)試劑（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；流式細(xì)胞儀和離心機(jī)（美國(guó)Bec km an Coulter公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 膜型CD28分子表達(dá)水平的檢測(cè) 取糖尿病組及對(duì)照組清晨空腹外周抗凝血各2 mL，加入流式管中（100μL／管），分別加入10μL／管的CD4-FITC＋CD28-PE或者CD8-FITC＋CD28-PE，并加入IgG1-FITC和IgG1-PE為同型對(duì)照，室溫避光孵育20 min后加入溶血?jiǎng)?00μL／管），充分混勻后37℃避光孵育10 min；加入預(yù)溫的蒸餾水，待管中液體澄清透明后，加入3 mL PBS洗滌1遍后，以0.5 mL PBS重懸細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組受試者外周血不同淋巴細(xì)胞亞群及膜型CD28的表達(dá)。

1.3.2 可溶性CD28水平的檢測(cè) 取上述各空腹外周抗凝血，4000 r／min高速離心（離心半徑10 cm）5 min分離血清后-20℃冷藏待檢。檢測(cè)前，將血清取出室溫解凍后，經(jīng)ELISA方法檢測(cè)可溶性CD28的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 5.01統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，正態(tài)分布的結(jié)果數(shù)據(jù)采用Kolmogorov -Smirnov檢驗(yàn)，組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。

表1 兩組外周血不同淋巴細(xì)胞亞群及膜型CD28的表達(dá)（s，%）

表1 兩組外周血不同淋巴細(xì)胞亞群及膜型CD28的表達(dá)（s，%）

組別例數(shù)CD4 CD8 CD4／CD8 CD28 CD4＋CD28＋CD8＋CD28＋對(duì)照組30 42.16±4.76 28.30±4.39 1.52±0.25 52.48±11 3.170 0.333 2.917 6.627 2.788 7.635 P值.53 32.77±4.28 18.53±3.27糖尿病組30 38.56±4.01 27.14±4.06 1.36±0.15 35.84±7.49 28.29±7.71 12.18±3.17 t值0.002 0.740 0.005 0.000 0.007 0.000

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者外周血不同淋巴細(xì)胞亞群及膜型CD28的表達(dá) 與對(duì)照組相比，糖尿病組外周血CD4＋T細(xì)胞、CD4／CD8、CD4＋CD28＋T細(xì)胞和CD8＋CD28＋T細(xì)胞均顯著減少（均P＜0.05），膜型CD28分子的表達(dá)顯著下降（P＜0.01），見表1。

2.2 兩組受試者血清中可溶性CD28含量 與對(duì)照組相比，糖尿病組血清中可溶性CD28含量顯著高于對(duì)照組［（2.86±0.96）μg／L比（0.61±0.19）μg／L，t＝12.60，P＝0.000］。

3 討論

2型糖尿病是一種自身免疫性的慢性非感染性疾病，主要由于胰島素抵抗和胰島素分泌不足導(dǎo)致的，常并發(fā)多種血管病變。近年來的研究顯示，2型糖尿病患者存在著免疫功能紊亂和炎癥介質(zhì)的增加，特別是T淋巴細(xì)胞的活化及功能的異常在2型糖尿病免疫病理機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者外周血中各免疫細(xì)胞亞群表達(dá)失調(diào)，無論是CD4＋T細(xì)胞還是CD8＋T細(xì)胞表面的膜型CD28分子的表達(dá)都顯著下調(diào)。近年來的研究表明，在某些病理狀態(tài)下，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［6］、多發(fā)性硬化癥［7］、強(qiáng)直性脊柱炎［8］和Wegener肉芽腫病等［9］自身免疫性疾病中，CD4＋T細(xì)胞表面的CD28分子表達(dá)下調(diào)。CD4＋CD28-T細(xì)胞盡管表面丟失了CD28分子，但其在缺失共刺激信號(hào)的情況下仍然能夠被功能性活化，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，造成組織損傷。該群細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，可以分泌細(xì)胞因子γ-干擾素（IFN-γ），IFN-γ通過血液或旁分泌作用干擾胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響胰島素敏感性，導(dǎo)致胰島素抵抗，參與糖尿病的免疫病理機(jī)制［10］。本研究結(jié)果提示2型糖尿病患者外周血中T細(xì)胞表面CD28分子的表達(dá)顯著減少，為2型糖尿病患者外周血中CD4＋CD28-T細(xì)胞的異常增加提供了佐證。

另外，本研究采用ELISA方法檢測(cè)了2型糖尿病患者和對(duì)照組外周血清中的可溶性CD28的含量。結(jié)果顯示，2型糖尿病患者外周血中可溶性CD28的含量較健康對(duì)照組顯著增加，提示很有可能T細(xì)胞表面膜型CD28分子脫落后進(jìn)入血液，導(dǎo)致了可溶性CD28的增加。

總的說來，2型糖尿病患者外周血中膜型CD28和可溶性CD28均存在異常表達(dá)，CD28作為重要的協(xié)同刺激分子，其介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號(hào)很有可能參與了2型糖尿病的免疫病理機(jī)制，其具體生物學(xué)作用尚待進(jìn)一步研究。

［1］ Magistrelli G，Jeannin P，Elson G，et al.Identification of three alternatively spliced variants of human CD28 mRNA［J］.Biochem Biophys Res Commun，1999，259（1）：34-37.

［2］ Dock JN，Effros RB.Role of CD8 T cell replicative senescence in human aging and in hiv-mediated immunosenescence［J］.Aging Dis，2011，2（5）：382-397.

［3］ Pieper J，Johansson S，Snir O，et al.Peripheral and sitespecific CD4＋CD28nullT cells from rheumatoid arthritis patients show distinct characteristics［J］.Scand J Immuno，2014，79（2）：149-155.

［4］ Chen C，Chen D，Zhang Y，et al.Changes of CD4＋CD25＋FOXP3＋and CD8＋CD28-regulatory T cells in nonsmall cell lung cancerpatients undergoing surgery［J］.Int Immunopharmacol，2014，18（2）：255-261.

［5］ Verspohl EJ.Novel pharmacological approaches to the treatment of type 2 diabetes［J］.Pharmacol.Rev，2012，64（2）：188-237.

［6］ Gerli R，Schillaci G，Giordano A，et al.CD4＋CD28-T lymphocytes contribute to early atherosclerotic damage in rheumatoid arthritis patients［J］.Circulation，2004，109（22）：2744-2748.

［7］ Miyazaki Y，Iwabuchi K，Kikuchi S，et al.Expansion of CD4＋CD28-T cells producing high levelsof interferon-γ in peripheral blood of patients with multiple sclerosis［J］.Mult Scler，2008，14（8）：1044-1055.

［8］ Duftner C，Dejaco C，Kullich W，et al.Preferential type 1 chemokine receptors and cytokine production of CD28-T cells in ankylosing spondylitis［J］.Ann Rheum Dis，2006，65（5）：647-653.

［9］ Lamprecht P，Moosig F，Csernok E，et al.CD28 negative T cells are enriched in granulomatous lesions of the respiratory tract in Wegener＇s granulomatosis［J］.Thorax，2001，56（10）：751-757.

［10］Hodgson KA，Govan BL，Walduck AK，etal.Impaired early cytokine responses at the site of infection in amurine model of type 2 diabetes and melioidosis comorbidity［J］.Infect Immu，2013，81（2）：470-477.

The significance and expression of serum membrane type CD28 and soluble CD28 of among 2 diabetes patients

ZHAO Jiangping*，CHEN Hailong，WANG Fengming（*Outpatient Department of Joint Logistics Department，Beijing Military Region，Beijing 100042，China）

WANG Fengming，Email：wfm0519＠hotmail.com

ObjectiveTo analyze the expression ofmembrane type CD28 and soluble CD28 in peripheral blood of type 2 diabetes patients.Methods The peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of 30 subjectswith type2 diabetes（diabetes group）and 30 healthy donors（control group）were collected from December 2012 to December2013 in the out-patient departmentof Outreach Logistics Departmentof Beijing Military Region.The expression of CD28 on T cells in peripheral blood of type 2 diabetes patients was detected by flow cytometry（FCM）.Thesecretion of soluble CD28 in serum was detected using the skills of Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The data was analyzed by the Graphpad Prism 5.01 program.ResultsThe percentage of CD4＋CD28＋and CD8＋CD28＋T cells in peripheral blood of type 2 diabetes patientswere（28.29±7.71）%and（12.18±3.17）%respectively，and were decreased markedly compared with healthy control（32.77±4.28%and 18.53±3.27%，P＜0.01 and P＜0.001）.Compared with control，the level of soluble CD28 was increased significantly in serum of type 2 diabetes patients（（2.86±0.96）vs（0.61±0.19）μg／L，P＜0.001）.Conclusion The costimulatory molecule CD28 maybe take part in the immunological pathogenesis of type 2 diabetes.

Diabetes Mellitus，Type 2；Antigens，CD28；T-Lymphocytes

R587.1

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.05.020

2014-06-02）

趙江萍，主管護(hù)師，Email：guchengerxiao＠163.com

王鳳鳴，博士，副研究員，Email：w fm0519＠hotmail.com