吳玉紅，邵 博，宋 鵬

（1.重慶警察學院，重慶 401331；2.黑龍江省公安廳，黑龍江 哈爾濱 150008；3.上海市公安局，上海 200025）

硅藻土提取LC-MS/MS法測定血液中馬錢子堿和士的寧

吳玉紅1，邵 博2，宋 鵬3

（1.重慶警察學院，重慶 401331；2.黑龍江省公安廳，黑龍江 哈爾濱 150008；3.上海市公安局，上海 200025）

用硅藻土提取血液中馬錢子堿和士的寧，用LC-MS/MS測定的方法。取檢血1.0毫升加水溶液1.0毫升倒入硅藻土層析柱中，加二氯甲烷洗脫，洗脫溶劑中添加內標SKF525A，濃縮至干。剩余物用1.0毫升甲醇溶解，進行LC-MS/MS分析。士的寧和馬錢子堿檢出限分別為1.9納克/毫升和2.3納克/毫升；提取率均達到95%以上；線性范圍0.01微克/毫升～10微克/毫升。該法可作為法醫(yī)毒物常規(guī)檢驗方法。

馬錢子堿；士的寧；血液；硅藻土；LC-MS/MS

馬錢子堿和士的寧共存于馬錢屬的許多植物中，是一種常見的生物堿。士的寧是一種中樞神經興奮劑，醫(yī)療上常用于治療弱視癥、癱瘓及再生障礙性貧血。馬錢子堿常用于治療中風引起的神經麻痹和用作健胃藥，使用不當或服藥過量，會引起中毒甚至死亡。

目前，生物檢材中馬錢子堿和士的寧的檢驗方法有紫外導數光譜法、［1］氣相色譜法、氣相色譜——質譜聯用法［2］和高效液相色譜法，［3］以氣相色譜——氣質聯用法最為常見。由于兩種生物堿分子量相對較大，不易汽化，應用氣相色譜和氣相色譜——氣質聯用法需采用較高的柱溫，靈敏度低，易造成柱流失，而采用高效液相色譜法易拖尾。為此，筆者建立了硅藻土提取方法和高效液相色譜——二級質譜聯用檢測技術，方法簡單快速，提取率高，靈敏度高。

一、實驗部分

（一）儀器、材料及試劑

LXQ液相色譜——質譜聯用儀（美國Thermo Fisher公司）。

硅藻土：上?；瘜W試劑廠進口分裝，粒度為0.02毫米~0.045毫米。

人血：購自黑龍江省中心血站，加抗凝劑袋裝保鮮人血，冷凍備用。

馬錢子堿、士的寧：分析純，質量符合國家藥典規(guī)定；用甲醇配制成1.0毫克/毫升標準溶液。

甲醇為色譜純；乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸銨溶液、醋酸、醋酸鈉、碳酸、碳酸氫鈉等均為分析純。

（二）檢測方法

1.儀器條件

液相條件：色譜柱HyPuRiTY C18 ODS（2.1毫米×150毫米 Column）（Thermo公司生產），流速0.20毫升/分鐘，采集時間15分鐘，進樣量10.0微升，流動相：甲醇——5毫摩爾/升，乙酸銨溶液（pH=3.0～4.0）=70∶30。

質譜條件：采用電噴霧電離（IonSprary）-陽離子模式（ESI+）進行MRM方式檢測，碰撞能量（CE）為35.0伏特，噴射電壓5千伏，毛細管溫度350攝氏度。

2.檢測方法

取檢血1.0毫升加水溶液1.0毫升倒入硅藻土層析柱中，加二氯甲烷洗脫，收集8.0毫升洗脫溶劑，添加5.0微升1.0毫克/毫升內標SKF525A，于50攝氏度水浴濃縮至干。剩余物用1.0毫升甲醇溶解。0.45微米濾膜過濾后，取10.0微升進行LC-MS/MS分析，內標標準曲線法進行定量分析。

二、結果與討論

（一）工作曲線的制備

取1.0毫升空白血檢材15份，分別加入0.01、0.1、1.0、5.0、10.0微克的士的寧、馬錢子堿標準樣品。按照上述方法進行提取，在洗脫液中分別添加SKF525標準品5.0微克，濃縮后取10.0微升進樣。繪制工作曲線，線性回歸方程及相關系數為：士的寧y=0.09x+0.01，r＝0.9897；馬錢子堿y= 0.31x+0.04，r＝0.9890。

（二）硅藻土萃取條件的確定

取空白血液1.0毫升，添加100.0微克/毫升混合標準工作液1.0微升。分別在pH5.0、pH7.0、pH9.0條件，用乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯下進行分別提取，提取率見表1。

表1 血液中士的寧、馬錢子堿在不同pH及洗脫溶劑條件下提取率考察（n=5）

實驗發(fā)現，血中士的寧、馬錢子堿的提取率受PH影響不大，用二氯甲烷作為洗脫溶劑，均能得到較好的提取效果。

（三）儀器條件的確定

1.質譜條件的優(yōu)化

采用注射泵直接進樣的方式，以20.0微升/分鐘將10.0納克/毫升的士的寧、馬錢子堿標準溶液和SKF525A對照品溶液分別注入離子源中，采用儀器自動調諧的方式，獲得最優(yōu)的質譜檢測條件，見表2。在正離子檢測方式下對它們進行一級質譜分析，得到2種化合物的分子離子峰，然后分別對準分子離子峰進行二級質譜分析。選擇士的寧、馬錢子堿和SKF525A的檢測離子對，見表3。

2.液相色譜條件的優(yōu)化

由于士的寧、馬錢子堿和SKF525A易溶于甲醇，選擇甲醇作為流動相之一，同時選擇水和5毫摩爾/升乙酸銨作為流動相之二。色譜結果表明，加入乙酸銨后峰形明顯改善，提示應選擇甲醇-5毫摩爾/升乙酸銨作為流動相溶劑。選擇不同比例（90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60）的甲醇-5毫摩爾/升乙酸銨溶液作為流動相，分別觀察它們的出峰情況。結果顯示，甲醇含量減少，出峰時間過長；甲醇含量過大，峰拖尾嚴重；選擇甲醇-5毫摩爾/升乙酸銨比例為70∶30時峰形和保留時間均較為合適。

表2 士的寧、馬錢子堿的質譜調諧參數

表3 士的寧、馬錢子堿檢測離子對

（四）檢出限

取空白血液1.0毫升5份，按文中方法進行提取，添加內標20納克/毫升進行測定，得到空白血色譜圖。另取血添加藥物20納克/毫升、內標20納克/毫升，同上進行提取測定，以“基線噪音”3倍的檢材藥物含量得檢出限。結果檢出限士的寧為1.9納克/毫升，馬錢子為2.3納克/毫升。

（五）提取率

取1.0毫升血液，分別添加士的寧、馬錢子堿0.1微克，1.0微克，10.0微克，按照本文“血液中士的寧、馬錢子堿提取方法”進行提取，使用LC-MS/MS檢測，所得2種藥物提取率見表4。

表4 血中士的寧、馬錢子堿的提取率（n=5）

（六）中毒實驗

取體重2.5千克家兔1只，灌服馬錢子堿30毫克，15分鐘處死，解剖取心血，按本文方法測定，測值為8.7微克/毫升。

［1］吳玉紅，許英鍵.血、尿中馬錢子堿硅藻土提取紫外三階導數光譜測定法研究［J］.廣東公安科技，2004，（4）.

［2］呂霞，郭青，鐘文英.GC—MS法測定疏風活絡丸中偽麻黃堿、麻黃堿、士的寧和馬錢子堿的含量［J］.中國藥科大學學報，2008，（6）.

［3］王朝虹，果德安，胡春華.反相高效液相色譜法測定全血中馬錢子堿和士的寧的含量［J］.色譜，2003，（4）.

（責任編輯：陳尚坤）

D918.93

A

1671-0541（2014）06-0049-03

2014-06-05

吳玉紅（1964-），女，遼寧大連人，重慶警察學院教授，主要研究方向：毒物分析；邵博（1982-），女，黑龍江哈爾濱人，黑龍江省公安廳從事表物分析工作；宋鵬（1983-），男，山東煙臺人，上海市公安局從事表物分析工作。

本文系重慶市公安局科研課題《植物毒素的提取與檢測技術研究》階段性研究成果，項目編號：G2013-26。