李勇杰 曾定尹

（遼寧省遼陽(yáng)市第三人民醫(yī)院循環(huán)內(nèi)科，遼寧 遼陽(yáng) 111000）

血管外膜慢性損傷通過(guò)CNP影響大鼠頸動(dòng)脈舒縮功能的實(shí)驗(yàn)研究

李勇杰 曾定尹

（遼寧省遼陽(yáng)市第三人民醫(yī)院循環(huán)內(nèi)科，遼寧 遼陽(yáng) 111000）

目的 探討血管外膜慢性損傷對(duì)動(dòng)脈血管舒縮反應(yīng)性影響的可能機(jī)制。方法 以硅膠管為實(shí)驗(yàn)研究工具，將大鼠頸動(dòng)脈進(jìn)行包裹，構(gòu)建血管外膜慢性損傷介導(dǎo)早期動(dòng)脈硬化動(dòng)物模型以及血管收縮性增強(qiáng)動(dòng)物模型，詳細(xì)觀察正常組與模型組血管組織中，CNP、cGMP、PKGⅠα和PKGⅠβ這四項(xiàng)指標(biāo)之間的表達(dá)變化。結(jié)果 就包管側(cè)右頸動(dòng)脈血管組織來(lái)講，在CNP、cGMP、PKGⅠα表達(dá)上，模型組較正常組雙側(cè)頸動(dòng)脈明顯減少，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；對(duì)于模型組中的包管側(cè)右頸動(dòng)脈血管組織而言，其中PKGⅠβ這項(xiàng)表達(dá)與其他組比較呈下降趨勢(shì)，但是組間對(duì)比差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.254）。結(jié)論 血管外膜慢性損傷早期階段可以引起血管慢性痙攣，血流量下降，血管對(duì)5-HT的反應(yīng)敏感性增加，局部血管組織中CNP的蛋白表達(dá)下調(diào)是血管外膜慢性損傷引起血管收縮反應(yīng)性增強(qiáng)的重要機(jī)制之一，并且CNP的降低血管收縮反應(yīng)性的作用同局部血管組織中PKGⅠα的表達(dá)密切相關(guān)，同局部血管組織中PKGⅠβ的表達(dá)關(guān)系不密切。

血管外膜慢性損傷；C-型利尿鈉肽；蛋白激酶G；環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇本市某動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科的健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量在300～350 kg，周齡在11～14周，所選大鼠為標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在普通飲食喂養(yǎng)1周后，對(duì)兩組大鼠進(jìn)行分組，分成正常組10只和模型組10只，繼續(xù)給予正常組大鼠2周的普通飲食，模型組大鼠在普通飲食喂養(yǎng)1周后，以硅膠管為實(shí)驗(yàn)研究工具，將大鼠頸動(dòng)脈進(jìn)行包裹，并繼續(xù)給予1周左右的普通飲食喂養(yǎng)。硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈手術(shù)在室溫下實(shí)施，麻醉選擇10%水合氯醛0.3 mL/100 g進(jìn)行，于大鼠腹腔部位注射，并以仰臥形式，在自制的40 cm×60 cm鼠板上進(jìn)行固定，為其進(jìn)行頸前脫毛，完成后常規(guī)條件下進(jìn)行消毒，具體可選擇碘酒或酒精等進(jìn)行，鋪好孔巾，切口定位在大鼠頸部皮膚，可沿正中線縱行實(shí)行，鈍性將頸部筋膜、肌肉等進(jìn)行逐層剝離，在右側(cè)頸動(dòng)脈鞘充分暴露的情況下，將右側(cè)頸動(dòng)脈進(jìn)行游離，沿縱行方向切開(kāi)后，選擇內(nèi)徑為1.5 mm的硅膠管對(duì)右側(cè)頸動(dòng)脈進(jìn)行包裹，另一側(cè)不作任何處理，最后對(duì)傷口進(jìn)行常規(guī)縫合，待大鼠自行恢復(fù)。

表1 各組頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化分析（n＝6，）

表1 各組頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化分析（n＝6，）

注：a.與模型組右頸動(dòng)脈相比P＜0.01

正常組左頸動(dòng)脈 模型組左頸動(dòng)脈 正常組右頸動(dòng)脈 模型組右頸動(dòng)脈EELA(mm2) 2.43±0.16a 2.44±0.21a 2.42±0.13a 1.78±0.12 IELA(mm2) 1.77±0.16a 1.91±0.18a 1.81±0.09a 1.07±0.11 MA(mm2) 0.65±0.06 0.69±0.09 0.60±0.07 0.70±0.06 MD(um) 109.29±10.95a 107.56±10.19a 102.76±9.61a 173.64±10.12

表2 各組頸動(dòng)脈血流量變化分析（n＝6，）

表2 各組頸動(dòng)脈血流量變化分析（n＝6，）

注：a.與模型組右頸動(dòng)脈相比P＜0.01

正常組左頸動(dòng)脈 模型組左頸動(dòng)脈 正常組右頸動(dòng)脈 模型組右頸動(dòng)脈基礎(chǔ)血流量(mL/min) 3.48±0.14a 3.67±0.28a 3.49±0.11a 2.60±0.21滴注5-HT后 2.90±0.13 2.97±0.21 2.92±0.10 1.61±0.19血流量變化率(%) 16.87±1.24a 17.90±1.78a 16.35±0.76a 38.22±3.10

1.3 病理學(xué)觀察分析：按照常規(guī)的病理學(xué)觀察方法來(lái)進(jìn)行，先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的選取，選擇符合實(shí)驗(yàn)要求的材料制作病理標(biāo)本，進(jìn)而開(kāi)展HE染色實(shí)驗(yàn)工作。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法分析：執(zhí)行試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，從而檢測(cè)正常組與模型組血管組織中cGMP含量以及血清中CNP含量的變化。

1.5 蛋白印記（Westen-blot）：遵循蛋白印記方法，檢測(cè)模型組與實(shí)驗(yàn)組大鼠右頸動(dòng)脈局部組織中PKGⅠα、CNP以及PKGⅠβ這三項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)，充分結(jié)合Gel-Analyzer軟件，詳細(xì)研究目的條帶，檢測(cè)目的條帶積分光密度值，進(jìn)而完成結(jié)果分析報(bào)告。

2 結(jié) 果

2.1 血管形態(tài)學(xué)改變探究：當(dāng)正常組與模型組的大鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈進(jìn)行HE染色后，借助普通光鏡進(jìn)行對(duì)比觀察。通過(guò)光鏡顯示下圖像發(fā)現(xiàn)，模型組左側(cè)頸動(dòng)脈無(wú)明顯病理改變，同時(shí)正常組雙側(cè)頸動(dòng)脈也無(wú)病理改變，但經(jīng)過(guò)7 d觀察后，模型組用硅膠管包裹的大鼠右頸動(dòng)脈發(fā)生病理改變，見(jiàn)圖1。其中病理改變主要體現(xiàn)在6個(gè)方面：①血管口徑顯著變小；②內(nèi)彈力板發(fā)生彎曲；③無(wú)明顯內(nèi)膜增生現(xiàn)象；④中膜增厚；⑤外膜出現(xiàn)輕度增生；⑥一部分炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果

模型組左頸動(dòng)脈同正常組雙側(cè)頸動(dòng)脈在血管形態(tài)上相比，外彈力板內(nèi)面積、內(nèi)彈力板內(nèi)面積、中膜厚度和中膜面積無(wú)明顯變化（P＞0.05）；模型組包管側(cè)右頸動(dòng)脈同正常組和自身左頸動(dòng)脈相比，內(nèi)彈力板內(nèi)面積、外彈力板內(nèi)面積明顯減小,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），中膜面積沒(méi)有明顯改變，中膜厚度明顯增加且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），提示硅膠管包裹頸動(dòng)脈早期階段血管腔縮小主要是源于中膜平滑肌的慢性收縮（表1）。

2.3 各組大鼠頸動(dòng)脈血流量的變化

結(jié)合以上形態(tài)學(xué)的結(jié)果，提示血管外膜損傷刺激引起的血管平滑肌的慢性持續(xù)性收縮，導(dǎo)致血流量下降；滴注藥物后各組血流量均減少，但正常組雙側(cè)頸動(dòng)脈、模型組左側(cè)頸動(dòng)脈的血流量變化率同模型組包管側(cè)右頸動(dòng)脈的血流量變化率相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），表明模型組右頸動(dòng)脈對(duì)5-HT的敏感性增加。見(jiàn)表2和圖2。

2.4 CNP在血清中的表達(dá)情況

運(yùn)用ELISA的方法測(cè)定兩組血清中的CNP含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：同正常組血清CNP（15.81±1.48）ng/L相比，模型組的血清CNP（13.81± 1.14）ng/L有所減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.064）。

圖1 硅膠管包裹對(duì)頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)影響（HE染色：a×100倍；b×200倍）

圖2 各組頸動(dòng)脈血流量變化分析（n＝6）

3 討 論

CNP作為鈉尿肽家族的新成員，其生理作用十分廣泛，功能上它與NO有著驚人的相似之處，二者相互作用、相互影響，保持著生物學(xué)功能上的完整性?？傊?，CNP是一種強(qiáng)的非內(nèi)皮依賴性的血管擴(kuò)張劑，實(shí)驗(yàn)證實(shí)CNP在心臟組織、外周血管及循環(huán)血中均有一定的分布，但較ANP為少，表明它是一種新型心血管活動(dòng)的輔助調(diào)節(jié)活性多肽，今后CNP可能作為選擇性心血管調(diào)節(jié)肽在調(diào)節(jié)血管張力中起重要作用。

R543.4

：B

：1671-8194（2014）05-0053-02

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目“973”計(jì)劃資助項(xiàng)目（課題編號(hào)：2005CB523310）