傅玉瓊 冉茂娟 周 偉 熊 彬 湛曉勤*

（四川省瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

PA感染與定植中細(xì)胞因子變化的研究

傅玉瓊 冉茂娟 周 偉 熊 彬 湛曉勤*

（四川省瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

目的 探討銅綠假單胞菌外毒素（PEA）在銅綠假單胞菌肺部感染及定植表達(dá)差異的臨床價值。方法 SD大鼠180只，隨機(jī)分為PA（銅綠假單胞菌）感染模型組，PA咽部定植組及生理鹽水對照組。取肺組織HE染色光鏡下觀察肺部炎癥情況。結(jié)果 ①細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果：模型組在接種后肺組織PA菌落數(shù)明顯升高；定植組咽拭子培養(yǎng)見大量PA生長；定植組及對照組肺組織未見PA菌生長；②模型組血清IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α表達(dá)在接種后第3、7、11天均明顯高于定植組及對照組（其差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。結(jié)論 血清細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α檢測有助于對銅綠假單胞菌感染與定植的鑒別診斷。

銅綠假單胞菌外毒素；酶聯(lián)免疫吸附法

銅綠假單胞菌外毒素A（Paeruginosa ExotoxinA，PEA）是銅綠假單胞菌的主要致病物質(zhì)，通過抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，95%以上臨床分離PA都會分泌這種毒素[1]，其基因高度保守。本實驗通過制作大鼠肺部感染及咽部定植模型并檢測血液中PEA 表達(dá)量的差異，為臨床上銅綠假單胞菌的感染和定植的鑒別提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

①清潔級健康雄性SD大鼠180只，體質(zhì)量200～250 g。②PA菌株：由本學(xué)院檢驗科提供分離出的標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌株，用分光光度比色法配成2個麥?zhǔn)蠁挝粷舛龋?×108cFu/mL）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立：所有動物均事先應(yīng)用地塞米松抑制免疫3 mg/(kg·d)，皮下注射，每日1次，連用7 d。將180只SD大鼠隨機(jī)分為三組（每組各60只），即模型組：從氣管內(nèi)注入0.4 mL銅綠假單胞菌混懸液（2個麥?zhǔn)蠁挝粷舛?×108cfu/mL）；對照組：從氣管內(nèi)注入0.4 mL生理鹽水；定植組：從鼻腔、咽部滴入相同的菌液濃度0.2 mL[6]。

1.2.2 取材：分別于接種后第3、7、11天取材，經(jīng)腹腔注射2%苯巴比妥（30 mg/kg）麻醉后，心臟采血方法處死，無菌取出肺組織。

1.2.3 組織病理學(xué)檢查：取出右側(cè)肺組織，10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片HE染色，光學(xué)下觀察。

1.2.4 IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α的測定：抗凝血離心后取上清液，收集標(biāo)本齊后，用ELISA試劑盒檢測。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法：本次研究所有患者的臨床資料均采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示（），計量資料用t檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗，組間對比采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有顯著性，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

肺組織細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果主要如下：模型組對象在接種之后的第3天和第7天，其PA菌落數(shù)均超過了106cfu//mL，而在第11天的時候其指數(shù)則超過104cfu/mL；定植組對象咽拭子在第3天和第7天的時候均能看見大量的PA菌被培養(yǎng)出來，到第11天時有所減少；定植組及對照組肺組織未見PA菌生長。

2.2 細(xì)胞因子測定

模型組、定植組還有對照組，其不同時間階段血漿中IL-6、IL-8、IFN-γ還有TNF-α等水平指數(shù)變化，詳情請見表1、表2。模型組中大鼠細(xì)胞因子的表達(dá)相對于其余兩組要高出許多，對比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；定植組和對照組兩組之間指數(shù)對比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；模型組中以第3天增高明顯（P＜0.05）。

3 討 論

銅綠假單胞菌（pseudomonad aeruginose，PA）是一種發(fā)病率高，致死性強(qiáng)的條件致病菌，近年來在院內(nèi)感染、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎以及ICU病房其發(fā)病率不斷增高，已成為該類人群致死致殘的重要原因之一。

由于本實驗中使用免疫抑制劑，使進(jìn)入肺內(nèi)的細(xì)菌不斷繁殖及毒素產(chǎn)生，引起組織破壞嚴(yán)重。接種后第3天細(xì)菌數(shù)量多、毒力強(qiáng)，機(jī)體免疫功能低下，以多核白細(xì)胞浸潤為主。多核白細(xì)胞是PA肺部感染早期主要的炎性細(xì)胞，其在清除病原體的同時也導(dǎo)致肺損傷。同時肺部PA感染時，能誘導(dǎo)體內(nèi)炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加，引起趨化肽釋放，細(xì)菌及毒素入血增加進(jìn)一步刺激細(xì)胞因子分泌，加重肺部炎癥。隨著時間延長，被抑制的免疫逐漸恢復(fù)，PA在體內(nèi)被吞噬細(xì)胞清除，使存留在肺內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量減少，肺部炎癥減輕同時炎性細(xì)胞因子釋放減少，肺部損傷減輕。因而我們可以檢測血清細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IFN-γ 、TNF-α的水平，依靠這種差異有助于銅綠假單胞菌感染與定植的鑒別。由此我們通過檢測血清細(xì)胞因子表達(dá)量的不同以期將感染與定植區(qū)分開，為臨床鑒別診斷PA感染及定植提供有力的實驗依據(jù)。

表1 各組大鼠不同時間血漿IL-6、IFN-Γ變化（，ng/L）

表1 各組大鼠不同時間血漿IL-6、IFN-Γ變化（，ng/L）

注：與定植組比較*P＜0.05；與對照組比較*P＜0.05

模型組 定植組 對照組IL-6 IFN-γ IL-6 IFN-γ IL-6 IFN-γ 3 d 108.67±10.21* 96.16±7.49* 57.05±7.01 42.33±7.37 55.83±9.66 39.05±8.17 7 d 89.17±9.01* 84.16±9.08 * 52.01±8.98 41.53±6.44 50.33±6.92 38.63±8.89 11 d 75±7.72* 59.33±5.27* 53.03 32±5.71 46.01±9.61 50.17±7.42 44.67±8.77

表2 各組大鼠不同時間血漿IL-8、TNF-α變化（，ng/L）

表2 各組大鼠不同時間血漿IL-8、TNF-α變化（，ng/L）

注：與定植組比較*P＜0.05；與對照組比較*P＜0.05

模型組 定植組 對照組IL-8 TNF-α IL-8 TNF-α IL-8 TNF-α 3 d 80.16±5.98* 121.83±11.72* 47.33±10.80 58.05±5.36 42.17±8.47 53.83±7.31 7 d 66.33±6.86* 83.66±11.34* 46.34±7.98 55.37±7.74 41.67±4.67 49.83±8.56 11 d 55.26±6.50* 67.01±7.04* 45.66±6.35 56.10±8.67 43.16±6.50 50.34±6.57

[1] Lglewski BH,Kabat D.NAD-dependent inhibition of protein synthesis by Pseudomonas aeruginasa toxin[J].Proc Natl Acad USA, 1975,72(6):2284-2288.

[2] 徐璇,鐘禮立,張兵,等.熒光實時定量PCR檢測銅綠假單胞菌方法建立及價值[J].中國醫(yī)師雜志,2006,8(12):1614-1617.

Study on the Changes of Cytokines for Differential Diagnosis of PA Infection and Colonization

FU Yu-qiong, RAN Mao-juan, ZHOU Wei, XIONG Bin, ZHAN Xiao-qin
(Department of Respiratory Medicine, The Affiliated Hospital of Luzhou Medcial College, Luzhou 646000, China)

Objective To explore the pseudomonas aeruginosa (PEA) toxic in pseudomonas aeruginosa lung infection and engraftment expression differences of clinical value. Methods 180 SD rats only randomly divided into PA (pseudomonas aeruginosa) infection model group, PA pharyngeal engraftment group and control group physiological saline. The lung tissue was observed by HE staining of lung inflammation under light. Results ①The results of bacterial culture:In the model group after inoculation with PA significantly increased lung colony number.②model group serum IL-6, IL-8, IFN-γ, TNF-α group and control group with an engraftment significant difference. Conclusion Serum cytokines IL-6, IL-8, IFN-γ, TNF- α detection is helpful in differential diagnosis of infection and colonization of Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas Aeruginosa Exotoxin; FQ-PCR

R563.1

：B

：1671-8194（2014）05-0029-02

*通訊作者：E-mail:490546615@qq.com