孫淑明 林豪雨 盧曉峰 梁偉全 謝舜峰

（汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，廣東 汕頭 515041）

外周血中PIPmRNA的表達及在乳腺癌微轉(zhuǎn)移中的臨床意義

孫淑明 林豪雨 盧曉峰 梁偉全 謝舜峰

（汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，廣東 汕頭 515041）

目的 探討泌乳素誘導蛋白( PIP) mRNA對乳腺癌微轉(zhuǎn)移的臨床價值。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應（RT-PCR）技術(shù)檢測75例乳腺癌患者、21例乳腺良性病變患者和20例健康者外周血中PIPmRNA的表達情況。結(jié)果 75例乳腺癌患者外周血中PIP mRNA有23例表達，陽性率為30.7%，乳腺良性腫瘤組和對照組中PIP mRNA表達為陰性。兩組比較差異有顯著性（P＜0.05）。PIPmRNA 陽性表達與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、原發(fā)腫瘤大小、分期顯著相關(guān)（P＜0.05）；而與患者的年齡、病理類型、ER、PR 等無顯著相關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論 外周血PIP mRNA陽性表達與乳腺癌微轉(zhuǎn)移有關(guān)。

泌乳素誘導蛋白；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應；乳腺腫瘤；微轉(zhuǎn)移

Fisher等認為乳腺癌是一種全身性疾病的局部表現(xiàn)，治療效果取決于確診時有無遠處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移和復發(fā)是乳腺癌致死的主要原因。若在亞臨床階段就能檢測到微轉(zhuǎn)移，那么對指導臨床的治療和判斷患者的預后都具有重要的實際意義。我們應用RT-PCR法，檢測乳腺癌患者外周血中PIP mRNA的表達，探討PIP mRNA與乳腺癌微轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，從而為臨床上診斷乳腺癌微轉(zhuǎn)移提供指導意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2007年8月至2010年7月在我院住院，經(jīng)病理確診的乳腺癌75例（女性74例，男性1例），平均年齡48.5歲（28～82歲）。浸潤性導管癌63例、髓樣癌4例、導管原位癌4例、黏液腺癌3例、粉刺癌1例。按TNM分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期47例、Ⅲ期15例、Ⅳ期5例。同期采集21例乳腺良性腫瘤患者和20例健康者（無乳腺疾病及其他腫瘤病史的女性）。全部患者在入院治療前均未行任何抗腫瘤治療，且具有完整的病理及病歷資料。

1.2 試劑及引物

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Taq和DNA Marker （大連寶生物公司）；引物由美國Invitrogen公司合成。PIPmRNA[1]的預期擴增片段為172 bp；上游引物：5'-GGCCAACAAAGCTCAGGACAAC-3'，下游引物：5'-TGCA CCTTGTAGAGGGATGCTG-3'。

1.3 方法

1.3.1 標本采集及保存：清晨空腹抽取外周淺靜脈血6 mL，立即加入EDTA抗凝試管，在2 h內(nèi)提取外周血單個核細胞，在液態(tài)氮中速凍15 min后放入-80 ℃冰箱中保存待用。全部按嚴格無菌操作采集標本。

1.3.2 RT-PCR反應：按一步法提取總RNA（TRIZOL法），根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PremixTaq說明書介紹的方法嚴格操作。用乳腺癌組織的cDNA作為陽性對照，去離子水作為陰性對照。

1.3.3 產(chǎn)物鑒定：由上海生工生物工程公司對PIPmRNA的PCR產(chǎn)物進行純化、測序并鑒定。

1.4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16·0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗、一致性檢驗用Kappa值分析、等級資料用Kendall進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 PIP mRNA的陽性表達：75例乳腺癌患者外周血標本中，有23例出現(xiàn)陽性表達，其陽性表達率為30.7%。乳腺良性腫瘤21例和健康對照組20例的外周血中均沒有表達，差異有統(tǒng)計學意義。PIPmRNA在各組中的表達情況（表1）。

表1 PIPmRNA在各組的表達情況

2.2 PIP mRNA 的陽性率與乳腺癌預后的關(guān)系

癌瘤的大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PIP mRNA 的陽性率成正相關(guān)關(guān)系。PIP mRNA 的陽性率隨癌瘤直徑的增大而明顯升高，在癌瘤直徑≤2 cm、2.0～5.0 cm及≥5 cm中，PIP mRNA的陽性率為12.5%、59.6%及75.0%，差異有顯著性（P＜0.05）；臨床Ⅲ～Ⅳ期患者PIP mRNA的陽性表達率為60.0%（12/20），顯著高于Ⅰ、Ⅱ期的12.5%和19.1%（P＜0.05）（表2）。PIP mRNA的陽性表達率與患者病理類型、年齡、月經(jīng)狀況未見有顯著性關(guān)系（表3）。 PIPmRNA的表達與臨床分期的關(guān)系見表2。

表2 乳腺癌組PIPm RNA的表達與TNM分期的關(guān)系

2.3 乳腺癌組PIPmRNA的陽性率與臨床病理學特征的關(guān)系

見表3。

表3 乳腺癌組PIPmRNA的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 測序結(jié)果

由上海生工生物工程公司對PCR產(chǎn)物做純化、測序，用GenBank基因序列作同源性對比，擴增產(chǎn)物為目的基因得到證實。

3 討 論

Fisher通過大量的實驗和臨床研究明確指出乳腺癌在確診時約50%己有微小轉(zhuǎn)移病灶，即使早期乳癌也可能是全身性疾病。乳腺癌死亡的主要原因是復發(fā)和轉(zhuǎn)移，如果能在亞臨床階段發(fā)現(xiàn)與乳腺癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的腫瘤標志物，并對其進行風險評估和早期干預，則對提高乳腺癌患者的生存率、降低病死率具有重要臨床意義。

外周血微轉(zhuǎn)移的檢測以其能反復采集標本，檢查方法簡單，準確性高，便于隨訪監(jiān)測等優(yōu)點而受到重視。通過檢測外周血特異性標志物來診斷乳腺癌微轉(zhuǎn)移，成為目前研究熱點之一。PIP被認為是一個特異性強且高度敏感的頂質(zhì)分泌細胞標志物[2]，該蛋白基因位于人7號染色體q34位點，能與CD4+T細胞受體結(jié)合，從而抑制CD4介導的T細胞程序性死亡。近年來，RT-PCR法因高靈敏性而常常用于做為對各種實體瘤微轉(zhuǎn)移的檢測方法[3,4]。Ring等[5]報道通過實時熒光定量PCR法檢測，將PIP作為檢測乳腺癌患者循環(huán)腫瘤細胞的標志物之一。我們用RT-PCR方法對75例乳腺癌患者外周血中PIPmRNA檢測，結(jié)果有23例檢出有特征性172 bp擴增條帶，陽性率為30.7%（23/75），而乳腺良性21例和健康者20例外周血均未查出有PIP mRNA，特異性 100%，跟文獻報道相一致。

近年研究表明，PIP 基因或蛋白高表達可作為乳腺癌特異標志物，用于預測早期微小轉(zhuǎn)移，并提示生存預后不佳[6-8]。將本實驗75例乳腺癌患者分為有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2組進行分析，結(jié)果有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 PIPmRNA 的陽性率為66.7%，無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽性率為10.0%，即伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，PIPmRNA的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P=0.006）。說明乳腺癌患者外周血PIPmRNA陽性率與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況有顯著性相關(guān)，外周血中PIP mRNA陽性表達在一定程度上能夠反映疾病的分期，而腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)是乳腺癌預后的重要指標之一，也進一步闡明微轉(zhuǎn)移與復發(fā)、預后的關(guān)系。Mitas等[9]采用RT-PCR對17個有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和51個無轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)作對照進行檢查，結(jié)果PIP的準確率為93.3%，認為PIP具有檢測乳腺癌微小轉(zhuǎn)移的潛在價值。鄭振東等[10]對50例乳腺癌患者外周血標本中，化療前17例PIP mRNA陽性的患者，經(jīng)2～3個周期化療后有13例轉(zhuǎn)為陰性，其轉(zhuǎn)陰率為76.5%，而在化療前PIPmRNA表達陰性的患者經(jīng)化療后全部無轉(zhuǎn)為陽性病例，化療前、后有統(tǒng)計學差異（P=0.001）。由此可見，乳腺癌患者術(shù)后輔助化療能夠降低血液PIP mRNA的陽性率，有望減少乳腺癌血液微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，動態(tài)監(jiān)測乳腺癌患者外周血中PIP mRNA表達，對于指導臨床治療、治療效果的判斷及預測預后具有實際臨床意義。

臨床資料表明，乳腺癌病期越晚，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的機會越大，治療效果越差。我們75例資料顯示：Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者外周血PIP mRNA的陽性表達率（60%）明顯高于Ⅰ（12.5%）、Ⅱ期（19.1%）患者（P=0.048＜0.05），可見病程越晚，出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的可能性也越大，同時Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌分別有12.5%和19.1%的陽性表達，提示早期乳腺癌也存在遠處轉(zhuǎn)移的可能，這也能解釋為什么部分早期乳腺癌患者預后較差的原因，因此臨床上在制訂治療方案前盡可能對是否存在微轉(zhuǎn)移作出診斷，有針對性制訂出多學科綜合的治療方案，提高乳腺癌的治療效果。

本研究也顯示乳腺癌患者外周血中PIP mRNA表達除與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)外，與患者年齡、月經(jīng)狀況、病理類型、腫瘤分化程度、ER、PR及HER-2等表達無關(guān)。PIP mRNA表達下調(diào)可顯著抑制乳腺癌細胞的遷移、黏附和侵襲能力，提示PIP mRNA與乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，其發(fā)揮作用的機制有待進一步研究。相信隨著人們對PIP mRNA在腫瘤細胞中功能和作用機制研究的不斷深入，必將為以PIP mRNA為靶點的抗腫瘤治療帶來希望。

[1] 韓正祥,張敬川,杜秀平,等.乳腺癌患者外周血中 PIP mRNA檢測的臨床意義[J].中華腫瘤防治雜志,2006,13(21):1635-1637.

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Clinical Significance of PIPmRNA Expression of Peripheral Blood in Micrometastasis of Breast Cancer

SUN Shu-ming, LIN Hao-yu, LU Xiao-feng, LIANG Wei-quan,XIE Shun-feng
(Department of Thyroid and Breast Surgery, the First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China)

Objective To assess the prognosis values of prolactin-induced protein(PIP) mRNA in breast carcinoma and tumor micrometastasis. Methods Peripheral serum samples of 75 patients with breast carcinoma, 21 patients with benign breast lesions and 20 controls were collected, PIP mRNA was assessed by RT-PCR. Results The positive rate of PIPmRNA in breast carcinoma patients, benign breast lesions and controls group was 30.7%, 0% and 0%. Significant differences were found in the expression of PIPmRNA in peripheral serum among patients with control groups, benign breast lesions patients with breast carcinoma (P＜0.05). The positive rates and related of PIPmRNA was significantly correlated with clinical stage (P＜0.05). There were no significant differences among any of age,histopathology types,estrogen receptor and progesterone receptor(P＞0.05). Conclusion Breast carcinoma and tumor micrometastasis patients with positive PIP mRNA was a close relationship.

Prolactin-induced protein; Reverse transcription polymerase chain reaction; Breast neoplasms; Tumor micrometastasis

R737.9

：B

：1671-8194（2014）05-0005-03

汕頭市科技局資助項目（2011-181）