趙宏霞，劉 瑜，莊哈娜

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院兒內(nèi)科，廣東深圳518028）

支氣管哮喘兒童的IL－17F基因突變分析

趙宏霞＊，劉 瑜，莊哈娜

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院兒內(nèi)科，廣東深圳518028）

目的探討白細(xì)胞介素－17F基因多態(tài)性與兒童支氣管哮喘的相關(guān)性，為支氣管哮喘的易感基因篩選提供可能的理論依據(jù)。方法取本院門診隨診的60例哮喘患兒設(shè)為哮喘組，60例健康兒童設(shè)為對(duì)照組，兩組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血2ml，提取全基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)及克隆、基因測(cè)序方法分析IL－17F基因序列rs763780（H161R）基因多態(tài)性。結(jié)果IL－17F基因序列rs763780（H161R）基因型在兩組內(nèi)均未檢測(cè)到突變型CC，rs763780（H161R）基因型（TC／TT）在兩組間內(nèi)的分布有明顯的差異（χ2＝5.71，P＜0.05）。TC基因型OR和95%可信區(qū)間（CI）為2.09（1.12－3.90），TT基因型OR和95%CI為0.76（0.60－0.95）。結(jié)論IL－17F基因多態(tài)性rs763780（H161R）基因型分布（TC／TT）在兩組間存在差異，其多態(tài)性可能與哮喘相關(guān)，兩組內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)基因型CC在，基因型TC可能是哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

哮喘；IL－17F基因；突變；DNA序列分析

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1649）

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞共同參與，以氣流受限、氣道重塑為特征的氣道炎癥性疾病，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)，每年因哮喘而死亡的病人數(shù)高達(dá)10萬(wàn)人，造成巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。支氣管哮喘的防治已成為當(dāng)今世界共同關(guān)注的公共健康問(wèn)題［1、2］。

遺傳及環(huán)境因素在哮喘中發(fā)揮著重要作用，隨著遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，有關(guān)哮喘遺傳易感性的研究引起了人們廣泛的興趣。目前發(fā)現(xiàn)有超過(guò)100個(gè)基因與哮喘相關(guān)。近年來(lái)，IL－17F基因多態(tài)性rs763780與哮喘的關(guān)聯(lián)性也引起了學(xué)者的關(guān)注。最新研究顯示在日本人群中rs763780（H161R）基因多態(tài)性（TC／CC）與哮喘的發(fā)病相關(guān)［3］，韓國(guó)學(xué)者Eun－Heui Jin等研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)序列rs1889570基因多態(tài)性與哮喘易感性有關(guān)［4］，Ramsey CD等研究非裔和歐裔美國(guó)女性包括rs763780在內(nèi)的50個(gè)SNPs未發(fā)現(xiàn)與哮喘相關(guān)［5］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于rs763780（H161R）基因突變與支氣管哮喘的相關(guān)性研究得出一致結(jié)論的報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用DNA測(cè)序法對(duì)哮喘兒童及健康兒童IL－17Frs1889570基因多態(tài)性檢測(cè)分析，探討IL－17Frs1889570基因多態(tài)性與兒童支氣管哮喘的相關(guān)性，為支氣管哮喘的發(fā)病易感基因篩選提供可能的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

①哮喘組：2011年3月－2012年10月于本院門診隨診的60例哮喘患兒，男38例，女22例，年齡2－15歲，平均5.3歲。均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)呼吸學(xué)組制定的兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)。

②對(duì)照組：2012年3月到2012年10月于本院健康體檢兒童60例，男36例，女24例；年齡2－14歲，平均5.2歲。

③兩組兒童組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，家長(zhǎng)均知情同意參加該研究。

1.2 標(biāo)本采集

哮喘組及對(duì)照組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血2ml，提取全基因組DNA，－20℃冰箱凍存?zhèn)錂z。

1.3 IL－17F序列rs763780（H161R）基因多態(tài)性檢測(cè)

1.3.1 全血基因組DNA的提取 采用苯酚／氯仿提取法，具體步驟按試劑說(shuō)明操作。

1.3.2 rs763780目的基因的擴(kuò)增 ①引物設(shè)計(jì)及合成：根據(jù)Genebank中rs763780（H161R）基因的序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司在DNA自動(dòng)合成儀上合成，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）純化。引物名稱、序列和預(yù)計(jì)等位基因片段大小等見(jiàn)表1。②PCR反應(yīng)體系和條件按常規(guī)進(jìn)行操作。

表1 引物名稱及序列

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 取PCR反應(yīng)液10μl，加入3μl溴酚蘭液，充分混勻，加入凝膠加樣孔中。接通電源，100V恒壓電泳約30min。將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)，判斷產(chǎn)物的存在。

1.3.4 目的基因測(cè)序?qū)⒌玫降腜CR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05作為差異有顯著意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 IL－17F基因序列rs763780（H161R）基因型分為野生型TT，突變型TC、CC，突變型CC在哮喘組和對(duì)照組均未檢測(cè)到，rs763780（H161R）基因型野生型TT，突變型TC在哮喘組和對(duì)照組內(nèi)的分布有明顯的差異（χ2＝5.71，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 TC基因型OR和95%可信區(qū)間（CI）為2.09（1.12－3.90），TT基因型OR和95%CI為0.76（0.60－0.95）。

表2 哮喘組與正常組IL－17F（H161R）基因型比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)哮喘病人經(jīng)過(guò)敏原刺激后IL－17基因表達(dá)上調(diào)［6］，在哮喘動(dòng)物模型也證實(shí)了IL－17F能增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)的過(guò)敏性炎癥反應(yīng)［7］，Chen J等證實(shí)了IL－17G－152A與兒童哮喘及肺部細(xì)菌感染有關(guān)［8］，Jin EH等對(duì)972例韓國(guó)人（其中哮喘患者424例）進(jìn)行IL－17F啟動(dòng)子基因多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)rs1889570基因分型與哮喘患者外周血嗜酸粒細(xì)胞數(shù)相關(guān)，其等位基因頻率與健康人群有差異，顯示IL－17F基因多態(tài)性與哮喘易感性存在相關(guān)性［9］。由此我們推測(cè)IL－17F可能是哮喘易感性良好的候選基因。

近10年來(lái)，一些學(xué)者研究了IL－17FHis161Arg與哮喘的相關(guān)性。Ramsey CD等［5］對(duì)1027名非裔和歐裔美國(guó)女性IL－17F基因分型后，對(duì)50個(gè)SNPs（包括rs763780在內(nèi)）進(jìn)行分析未發(fā)現(xiàn)與哮喘易感性有明顯相關(guān)性。MD Bazzi等［10］對(duì)202例沙特阿拉伯人進(jìn)行IL－17A及IL－17F基因多態(tài)性分析，僅發(fā)現(xiàn)IL－17A的一個(gè)SNP rs17880588（G／A）與哮喘相關(guān)，而IL－17Frs763780與哮喘并無(wú)關(guān)聯(lián)。與之相似，Eun－Heui Jin等人［9］在韓國(guó)人群中分析IL－17F多態(tài)性，并未發(fā)現(xiàn)SNP rs763780與哮喘相關(guān)。日本學(xué)者［7］分析了867人rs763780（H161R）在內(nèi)的5個(gè)基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)IL－17FH161R多態(tài)性可能與哮喘的易感性有關(guān)，且經(jīng)校正后發(fā)現(xiàn)IL－17F（H161R）突變的純合子CC可能與與哮喘的患病風(fēng)險(xiǎn)負(fù)相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)組人員于體外功能實(shí)驗(yàn)揭示了IL－17F第3外顯子上組氨酸突變?yōu)榫彼?，影響IL－17F與受體的結(jié)合力，造成其功能的缺失。不同人群中SNP的分布頻率不同，在Ramsey CD的研究中H161R在歐裔美國(guó)人的突變率為4.5%，遠(yuǎn)低于日本人（11.4%）。哮喘是一種復(fù)雜的多基因遺傳傾向的疾病，人體中基因與基因之間有著相互作用及累積效應(yīng)，環(huán)境因素如吸煙（被動(dòng)或主動(dòng)）、空氣中粉塵、寵物、職業(yè)暴露等等也影響哮喘的易感性。這些均可造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用DNA測(cè)序法對(duì)哮喘兒童及健康兒童基因IL－17Frs763780（H161R）進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果顯示兩組兒童均未發(fā)現(xiàn)CC純合子，野生型TT與突變型TC在兩組間存在差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)兩組基因型進(jìn)行危險(xiǎn)度分析顯示，TC可能為哮喘的危險(xiǎn)因素［OR 2.09，95%CI（1.12－3.90）］。我們推測(cè)IL－17FHis161Arg作為功能位點(diǎn)，單個(gè)堿基的突變，引起編碼蛋白質(zhì)的變化，從而影響IL－17信號(hào)傳導(dǎo)及生物學(xué)功能。我們對(duì)哮喘易感基因研究的最終目的是為了能從基因水平篩選哮喘易感人群，早期診斷，早期干預(yù)，并進(jìn)行更有效的基因治療。相信IL－17FHis161Arg的進(jìn)一步研究能為哮喘易感性篩查提供新的遺傳學(xué)標(biāo)記，也能為哮喘基因治療及藥物的研發(fā)提供新的理論依據(jù)。

［1］Eisner MD，Anthonisen N，Coultas D，et，al.An official American Thoracic Society public policy statement：Novel risk factors and the global burden of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，182（5）：693.

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Analysis of IL－17F Mutation in Children Asthma

ZHAO Hong－xia，LIU Yu，ZHUANG Ha－na.（Department of Ped－

iatric，Shenzhen Maternity and Children Health Care Hospital Affiliated to Southern Medical University，Shenzhen 518028，Guangdong Province，China）

ObjectiveTo explore the correlation between IL－17Fgene polymorphism and children asthma，providing some theoretical basis for pathophysiology and identification of susceptibility to asthma.Methods60Follow－up children with asthma in clinic were enrolled randomly to be asthma group，sixty healthy children were set as control group.2ml peripheral vein blood was drawn from each child with empty stomach in early morning.Each blood sample was extracted genomic DNA，Polymerase chain reaction（PCR），gene clone and DNA sequencing were used to analyse the IL－17Fpolymorphisms（rs763780）.ResultsThe H161Rhomozygote（CC）is not found in both asthma group and health group.Significant deviations from the genotypes（TC／TT）of rs763780were found in the asthma and health group.（χ2＝5.71 P＝0.017＜0.05）.The OR for asthma was 2.09（95%CI，1.12－3.90）for the H161Rmutant type（TC），the OR for asthma was 0.76（95%CI，0.60－0.95）for the H161Rwild type（TT）.ConclusionSignificant deviations from the genotypes（TC／TT）of IL－17Frs763780were found between the asthma and control groups，the polymorphisms may be associated with asthma.The H161Rhomozygote（CC）is not found in both groups，The H161Rmutant type（TC）may be the risk of asthma.

asthma；IL－17Fgene；mutation；DNA sequencing

R562.2＋5

A

趙宏霞，女，主任醫(yī)師，博士學(xué)位，碩士生導(dǎo)師，研

2013－07－22）

1007－4287（2014）10－1649－03

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（200702077）

＊通訊作者

究方向?yàn)樾汉粑到y(tǒng)疾病。