劉俊寶，曹 璐，冷維春

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長春130033）

卵巢上皮性癌中Smac蛋白的表達及臨床意義

劉俊寶，曹 璐，冷維春＊

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長春130033）

目的探討研究Smac蛋白在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢上皮性癌中的表達及與卵巢上皮性癌臨床病理特征的關(guān)系。方法 隨機選取吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院2008年1月－2009年10月間手術(shù)切除的卵巢組織標(biāo)本，其中正常卵巢組織20例、卵巢良性上皮性腫瘤組織20例和卵巢上皮性癌組織60例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對組織進行染色，以檢測Smac的表達情況。結(jié)果Smac蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達明顯低于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織（P＜0.05），并且Smac蛋白的表達隨著組織病理分級的升高而逐漸減弱（P＜0.05），隨著手術(shù)病理分期的升高而逐漸減弱（P＜0.05），但在不同的組織學(xué)類型中的表達無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論Smac的低表達可能促進卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，可能預(yù)示著腫瘤更具有侵襲性和不良的預(yù)后。

卵巢上皮性癌；Smac蛋白；免疫組化

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1618）

近年來，卵巢惡性腫瘤已經(jīng)成為病死率最高的婦科惡性腫瘤，而在卵巢惡性腫瘤中卵巢上皮性癌占到85%－90%。在我國其發(fā)病率繼續(xù)呈上升趨勢，且趨向于年輕化，同時隨之而來的腫瘤細(xì)胞耐藥問題進一步降低了患者的5年生存率。細(xì)胞凋亡是維持機體內(nèi)平衡的重要機制，因此腫瘤細(xì)胞通過各種途徑逃逸凋亡成為了惡性腫瘤發(fā)生的重要機制之一［1］；而且也是腫瘤細(xì)胞耐藥的重要原因，這也就使細(xì)胞凋亡基因的研究成為了熱點。

第二個線粒體來源的胱氨酸酶激活劑（Smac，second mitochondria－derived activator of caspas－es），是由Wang實驗小組［2］和Verhagan實驗小組［3］在2000年先后從Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞中分離出來一種蛋白質(zhì)，定位于線粒體上，在細(xì)胞凋亡過程中有重要的作用［4］，其低表達可能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測Smac蛋白在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢上皮性癌中的表達，以期在卵巢癌的診斷、治療及預(yù)后中起到一定的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院2008年1月－2009年10月間手術(shù)切除的組織標(biāo)本，其中正常卵巢組織20例、卵巢良性上皮性腫瘤組織20例和卵巢上皮性癌組織60例?；颊叩牟±±碣Y料完整，年齡在35－77歲之間，平均年齡45歲，所有患者術(shù)前都沒有進行放、化療和各種激素治療，也沒有合并其他任何系統(tǒng)的惡性腫瘤。卵巢上皮癌標(biāo)本根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO，International Federation of Gynecology and Obstetrics）標(biāo)準(zhǔn)進行臨床分期和病理組織學(xué)分級。其中Ⅰ、Ⅱ期共30例，Ⅲ、Ⅳ期共30例，高分化組（G1）16例，中分化組（G2）12例，低分化組（G3）32例，按組織學(xué)分型漿液性囊腺癌25例，粘液性囊腺癌25例，子宮內(nèi)膜樣癌10例。

1.2 方法

Smac兔抗人單克隆抗體（濃縮型）購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，Smac抗體工作濃度為1∶100。多聚HRP／AP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物制品有限公司。具體操作按試劑盒說明書嚴(yán)格進行，以PBS代替一抗設(shè)立陰性空白對照。

1.3 結(jié)果判定

每張切片均在雙盲下進行判定，陽性表達為鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，在細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒，且染色明顯高于背景。根據(jù)免疫組化評分方法對陽性細(xì)胞著色強度記分，然后在高倍鏡下連續(xù)計數(shù)1000個細(xì)胞，對陽性細(xì)胞所占百分比進行評分，根據(jù)兩者結(jié)果進行分析，取兩者評分之乘積，結(jié)果＞3分為陽性，0－3分判為陰性。

1.4 統(tǒng)計方法

顯著性檢驗采用χ2檢驗，當(dāng)T＜1或n＜40采用精確概率法，求P值。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計都在SPSS17.0軟件上進行。

2 結(jié)果

2.1 正常卵巢組織中、卵巢良性腫瘤組織、卵巢上皮癌中Smac蛋白的表達

Smac蛋白的陽性顆粒呈棕黃色，主要分布于細(xì)胞漿中，偶表達于胞核內(nèi)，其在3組標(biāo)本中均有表達，但從正常卵巢組織到卵巢良性上皮性腫瘤組織到卵巢上皮性癌組織中的表達率呈逐漸遞減的趨勢，依次為90.0%、85.0%，56.7%，卵巢上皮性癌組織中Smac的表達明顯低于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織，存在顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝10.78，P＜0.05）。但是正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織中Smac的表達無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（χ2＝0，P＞0.05），詳見表1。

2.2 Smac蛋白的陽性表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關(guān)系

表1 Smac蛋白在不同卵巢組織中的表達

Smac蛋白在卵巢上皮性癌高分化組中的陽性表達率為75.0%，中分化組的陽性表達率為75.0%，低分化組中表達率為40.6%，3組間比較，χ2＝7.19，P＜0.05，其表達存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異。可見隨著組織病理分級的升高，Smac蛋白表達逐漸減弱。

在手術(shù)病理分期中Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ、Ⅳ期陽性表達率分別為70.0%、43.3%，二者相比，χ2＝4.34，P＜0.05，存在顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。Smac蛋白的表達隨著手術(shù)病理分期的升高而逐漸減弱。

在卵巢上皮癌的組織學(xué)分型漿液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宮內(nèi)膜樣癌中的表達率依次為56.0%、64.0%、40.0%，三者進行比較，χ2＝1.68，P＞0.05，差異不顯著，無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 Smac蛋白的陽性表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

Smac基因位于12號染色體長臂，由7個外顯子組成。成熟的Smac分子含有184個氨基酸，相對分子質(zhì)量為21×103，等電點PI為5.3［5］。在Smac分子的氨基端有一段由丙氨酸、擷氨酸、脯氨酸和異亮氨酸組成的AVPI序列，又稱為凋亡抑制蛋白結(jié)合模體，是Smac行使功能所必須的。Smac促進細(xì)胞凋亡的機制：①在胞質(zhì)內(nèi)，Smac可以減弱或者去除IAP對caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的抑制作用，而達到促凋亡的功能［6］。②caspase－3是受體介導(dǎo)和線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑的共同的效應(yīng)劑，而成熟的Smac蛋白不但能促進caspase－3前體的活化而且還可以增加已活化的caspase－3的活性［7－8］從而促進細(xì)胞凋亡。③Smac蛋白可以促進凋亡抑制蛋白的泛素化使其降解，從而減弱或消除其凋亡抑制作用。④還有研究表明Smac可以使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)G0／G1期停滯而發(fā)揮抗腫瘤作用［6］，但是具體機制有待于進一步研究。

相關(guān)文獻報道［9］在腫瘤組織中Smac蛋白呈低表達甚至缺失。Yoo［10］等人通過免疫組化分析，結(jié)果顯示：胃癌、結(jié)腸癌、橫紋肌肉瘤、肺癌、惡性皮膚纖維瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、前列腺癌及平滑肌肉瘤中Smac蛋白的陽性表達率分別為70%（42／60）、70%（7／10）、45.5%（5／11）、40%（4／10）、28.6%（2／7）、25%（2／8）、20%（2／10）、16.7%（1／6），而在8例血管肉瘤及8例脂肪肉瘤中無表達。而本研究中，Smac蛋白在正常卵巢組織、卵巢良性上皮性腫瘤、卵巢上皮性癌中陽性表達率分別為：90%、85%、56.7%。由此推測Smac／DIABLO低表達可能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。Sekimura等［11］在88個肺癌組織樣本中用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測Smac mRNA的表達，研究表明Smac mRNA低表達的病人預(yù)后差。Mizutani等［12］在78例新鮮腎細(xì)胞癌標(biāo)本中用Western blot測定的Smac蛋白表達，發(fā)現(xiàn)Smac的表達與腎細(xì)胞癌的臨床分期和預(yù)后有顯著相關(guān)性。這與我們的研究結(jié)論是一致的，說明Smac的低表達可能預(yù)示著腫瘤更具有侵襲性和不良的預(yù)后，同時其在晚期（Ⅲ－Ⅳ期）卵巢上皮性癌中的表達低于早期（Ⅰ－Ⅱ期）卵巢癌的表達，這進一步說明了Smac低表達在卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

卵巢癌患者對化療耐藥是導(dǎo)致患者生存率降低的一個重要原因。而在腫瘤中Smac的高表達可促進腫瘤細(xì)胞凋亡，并增加腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性。鄭麗端［13］等研究表明在胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染外源性Smac基因，并使其呈過表達狀態(tài)，能提高MKN－45對化療藥物的敏感性。同樣有實驗表明［12］轉(zhuǎn)染Smac基因至腎癌組織中也能增加腎癌細(xì)胞對TRAIL／順鉑誘導(dǎo)凋亡的敏感性。McNeish等［14］將自行構(gòu)建的Smac腺病毒載體轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞中，結(jié)果顯示卵巢癌細(xì)胞對化療和放療的敏感性均明顯增加。Jia［15］及Fulda［16］也用相關(guān)實驗證明了此結(jié)論。由此可見，如果在卵巢癌細(xì)胞中能增強Smac基因的表達，就有可能促使癌細(xì)胞加速凋亡，從而克服化療耐藥問題，當(dāng)然，這仍然有待于我們進一步探究?？聘苯淌凇⒏敝魅吾t(yī)師。

［1］劉俊華，吳紀(jì)祥，劉益飛，等.Livin在非小細(xì)胞肺癌中的表達及臨床意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18（2）：247.

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Expression and clinical significance of Smac in epithelial ovarian carcinoma tissues

LIU Jun－bao，CAO Lu，LENG Wei－

chun.（Department of Obstetrics and Gynecology，China－Japan Union Hopsital，Jilin University，Changchun130033，China）

ObjectiveTo study the expression of Smac protein in normal ovarian tissues，benign ovarian tumor and epithelial ovarian carcinoma tissue and to clarify the relationship between Smac protein and clinical pathological features of epithelial ovarian carcinoma tissue.MethodsSurgical resection specimens in the China－Japan Union Hopsital of Jilin University from January 2008to October 2009were selected，including 20cases of normal ovarian tissue，20cases of benign ovarian epithelial tumors and 60cases of epithelial ovarian carcinoma.The expression of Smac protein were detected by immunohistochemical methed.Resultsthe expression of Smac protein in epithelial ovarian carcinoma tissues was significantly lower than in normal ovarian tissues and benign tumor tissues（P＜0.05）.The expression of Smac protein was gradually weakened with the increase of histopathological grades and surgical stage（P＜0.05），but there was no significant in different histological types（P＞0.05）.ConclusionThe low expression of Smac protein may contribute to the incidence and development of epithelial ovarian carcinoma，and its low expression may presage a more aggressive tumor and poor prognosis.

epithelial ovarian carcinoma；Smac protein；Immunohistochemical method

R737.31

A

2013－08－06）

劉俊寶（1974－），男，吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)

1007－4287（2014）10－1618－03

＊通訊作者