趙科研，王輝山，尚長青，張繼存，侯明曉＊

（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院1.心血管外科；2.急診醫(yī)學部，遼寧沈陽110016）

大鼠左側(cè)頸總動脈與頸外靜脈吻合分流性肺動脈高壓模型建立

趙科研1，王輝山1，尚長青2，張繼存2，侯明曉1＊

（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院1.心血管外科；2.急診醫(yī)學部，遼寧沈陽110016）

目的建立大鼠左頸總動脈與左側(cè)頸外靜脈吻合分流性肺動脈高壓模型。方法成年雄性Wistar大鼠隨機分為三組：吻合組（A組，n＝15），結(jié)扎組（B組，n＝15），正常組（C組，n＝15）。飼養(yǎng)3月后測定血流動力學指標，右心室／左心室＋室間隔質(zhì)量比，肺組織切片病理變化，ELISA方法測定血漿ET－1濃度，熒光定量PCR測定肺組織表達內(nèi)皮素－1mRNA的變化。結(jié)果與B，C兩組相比，A組：右心室收縮壓力明顯升高，血清內(nèi)皮素－1水平升高，熒光定量PCR結(jié)果顯示A組內(nèi)皮素－1mRNA的相對表達量是B組的2.601倍，是C組的3.373倍，B組是C組的1.297（P＜0.05）。結(jié)論通過分離左頸總動脈及左頸外靜脈切斷后，近心端吻合，可成功建立模擬先天性心臟病的分流性肺動脈高壓模型，作為肺動脈高壓標志的內(nèi)皮素－1在此模型中處于高表達狀態(tài)。

分流性；動物模型；肺動脈高壓；內(nèi)皮素－1

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1586）

肺動脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH）在先天性心臟病中常見，主要為左向右分流導致肺血流明顯增加，繼發(fā)肺血管內(nèi)膜纖維化，動脈中層肥厚，甚至肺小動脈阻塞等叢樣損害為主，病變大部分相似［1］。建立良好的肺動脈高壓模型是研究PAH的發(fā)病機制及臨床治療的基礎(chǔ)。流量誘導的肺高壓患者具有明顯的圍手術(shù)期死亡率和心臟手術(shù)較低的長期存活率［2］。本研究采用大鼠左側(cè)頸總動脈和頸外靜脈吻合方法建立分流模型，對于研究先天性流量增加的肺動脈高壓具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗對象 成年雄性Wistar大鼠45只，體重150－200g，6周齡。購自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心。

1.1.2 主要藥品、試劑與儀器 熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物），內(nèi)皮素－1ELISA試劑盒（大連寶生物），DNA擴增儀（PT－200型，為美國PE公司），熒光定量PCR擴增儀（美國Applied Biosys－tems公司GeneAmp7300）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的分組和模型建立 實驗動物大鼠按體重隨機分為三組：A.手術(shù)組（n＝15）；B.假手術(shù)組（n＝15）；C正常組（n＝15）。A組稱重，腹腔注射戊巴比妥25mg·kg－1行全身麻醉［4］，四肢及頭部固定于小手術(shù)臺面。頸部縱行切口，約1.5cm，分離皮下組織及肌層，暴露左頸外靜脈及左頸總動脈，充分游離，無創(chuàng)血管夾阻斷近心端，遠心端結(jié)扎、切斷，生理鹽水沖洗近心端至無血栓，11－0無創(chuàng)線間斷端端吻合兩血管，撤除血管夾，調(diào)整血管及松解周圍組織。B組只分離左頸外靜脈及左頸總動脈，分別做結(jié)扎術(shù)，不做吻合術(shù)；C組為正常大鼠，不做任何處理。3月后再次麻醉檢查以下指標。

1.2.2 血流動力學指標 右心微導管測右心室收縮壓（RVSP），壓力波形經(jīng)BL－420E系統(tǒng)記錄并保存。

1.2.3 肺組織病理學觀察 取大鼠的肺組織，置于10%中性福爾馬林液中固定，經(jīng)常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，經(jīng)HE染色，光學顯微鏡觀察肺組織。

1.2.4 ELISA方法測定血漿內(nèi)皮素－1（Endothelin－1，ET－1）濃度 步驟嚴格按照內(nèi)皮素－1試劑盒說明書進行操作。根據(jù)標準品所測到的OD值作圖，繪制標準曲線。統(tǒng)計各個樣品的OD值，大鼠的內(nèi)皮素－1含量與該曲線OD值相對應(yīng)，分別查出并做好記錄。

1.2.5 定量PCR測定肺組織表達內(nèi)皮素－1mRNA的變化 ET－1和GADPH的基因序列通過基因庫獲得，引物設(shè)計結(jié)合參考文獻和DNASIS軟件（HITACHI SOFRWARE ENGINEERI NGCO. LTD）設(shè)計。ET－1上游引物5′－GCA TCC GCT GGT AGC AAG TGA－3′：ET－1下游引物5′–TCT ACA GAA ACT CCG CCC TGC－3′，GAPDH上游引物：5′－CGG AGT CAA CGG ATT TGG TGG TAT－3′；GAPDH下游引物：5′－AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC－3′。提取總RNA，采用目的基因和內(nèi)參基因進行熒光定量PCR反應(yīng)，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，檢測上述基因mRNA表達。溶解曲線都有各自的CT值，采用相對量法即△△CT法［5］計算?！鰿T（目的基因）＝CT（目的基因）－CT（內(nèi)參基因），△△CT＝△CT（實驗組）－△CT（對照組），目的基因相對表達水平＝2T－△△Ct，2T－△△Ct就是表示實驗組目的的基因表達是對照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可以直接得到的目的基因相對于管家基因的定量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法 數(shù)據(jù)采用x—±s表示，進行兩樣本均數(shù)的t檢驗（SPSS13.0，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義）。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

3月后各組大鼠未表現(xiàn)明顯精神萎靡，進食減少，體重下降等，亦無肢體偏癱及精神異常等表現(xiàn)。

2.2 血流動力學指標

右心室收縮壓力［6］所測到的數(shù)值可見，A組的3月后右心室收縮壓力35.67±3.48mmHg明顯高于B組27.34±2.79mmHg和C組24.53±3.24 mmHg，B組略高于C組（P＜0.05）。

2.3 肺組織病理學觀察

實驗組肺小動脈管壁明顯增厚，假手術(shù)組肺小動脈管壁薄，淋巴細胞較少，見圖1。

圖1 肺組織病理學觀察

2.4 ELISA方法測定血漿ET－1濃度

經(jīng)檢測可以看出A組大鼠血清中的內(nèi)皮素－1的含量（35.59±6.04）ρ／ng·L－1明顯高于B組（29.41±3.48）ρ／ng·L－1，C組（26.45±2.53）ρ／ng·L－1，B組血清中的內(nèi)皮素－1的含量略高于C組（P＜0.05）。

2.5 熒光定量PCR測定

結(jié)果顯示，各組基因擴增的動力學曲線形狀較為規(guī)整，基線水平較好，無上揚趨勢，并且拐點清楚。各組的增長曲線［8］都符合標準的“S”型曲線。各組的△CT平均值后整理為下表1。

表1 三組的△CT平均值

最后根據(jù)公式目的基因的相對表達水平＝2T－△△Ct進而求出結(jié)果，如A組和C組相比較，結(jié)果＝2T－（9.50－11.65）＝3.373，意義為A組大鼠的肺組織內(nèi)皮素－1mRNA的表達量是C組的3.373倍（P＜0.05）。依次計算可得，A組大鼠的肺組織內(nèi)皮素－1mRNA的表達量是B組的2.601倍（P＜0.05），B組是C組的1.297倍（P＜0.05）。

3 討論

分流法可以模擬先天性心臟病如動脈導管未閉、室間隔缺損、房間隔缺損等常伴有大量左向右血液分流［3］，超過肺血管代償擴張限度，肺血管床容積相對不足，將直接導致肺動脈壓力增高，可用于先天性心臟病肺動脈高壓研究。

本實驗通過動靜脈吻合方法建立小動物分流模型通暢率高，與傳統(tǒng)的穿刺法及導管結(jié)扎法相比方法確實，可重復(fù)性好；穿刺法一般多采用下腔靜脈－腹主動脈，分流量不好控制。

ET［4，5］是目前體內(nèi)最強大的具有收縮血管性能的特性物質(zhì)，與多種疾病的病理生理變化密切相關(guān)，與具有舒張功能的一氧化氮［6］共同影響心功能。內(nèi)皮素可以直接收縮肺血管，可以刺激肺動脈血管平滑肌DNA的合成和增殖［79］。Rubens C等［10］證實，循環(huán)中ET－1的水平是特發(fā)性肺動脈高壓的標志，可以作為選擇能夠從ET受體拮抗劑治療獲得益處的患者的工具。本研究通過熒光定量測定肺組織表達ET－1mRNA的變化，采用血漿ET－1濃度來作為評測肺動脈高壓的一個因素，為進一步實驗提供了可靠依據(jù)。

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Establishment model of new pattern and arteriovenous shunt of pulmonary artery hypertension in rats

ZHAO Ke－yan，

WANG Hui－shan，SHANG Chang－qing，et al.（Department of Cardiac Surgery，Shenyang Northern Hospital，Shenyang110016，China）

ObjectiveTo establish arteriovenous shunt of pulmonary artery hypertension by anastomosis of the left common carotid artery and left external jugular vein.MethodsAdult male Wistar rats were randomly divided into three groups：anastomosis group（group A，n＝15），ligation group（group B，n＝15），normal group（group C，n＝15）.After feeding 3months，hemodynamic index，pathological changes of myocardial tissue and lung biopsy，the plasma ET－1concentration，and the change of lung tissue endothelin－1mRNA were determined.ResultsCompared with group B and C，the right ventricular systolic pressure increased significantly in group A.The concentration of plasma endothelin 1was higher significantly in group A than group B and C（P＜0.05）.Fluorescence quantitative PCR results showed that the relative expression level of endothelin 1mRNA in group A is 2.601times of that in group B，3.373times of that in group C，and that in group B is 1.297times of that in the group C（P＜0.05）.ConclusionThe arteriovenous shunt of pulmonary artery hypertension can be established successfully through anastomosis of the left common carotid artery and left external jugular vein.Endothelin－1is in a state of high expression in this model.

shunt；animal model；pulmonary artery hypertension；endothelin－1

R544.1＋6

A

2013－08－20）

1007－4287（2014）10－1586－03

中國博士后科學基金（2013M542471）；遼寧省科技攻關(guān)基金（2012225014）

＊通訊作者