孫卉玲

高效液相色譜法測定美托拉宗片在人體內(nèi)的血藥濃度

孫卉玲

使用反相LichroCART Purospher C18色譜柱，流動相為乙腈和0.5%三乙醇胺（35:65）洗脫15min。應(yīng)用帶有光電二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀檢測美托拉宗。檢測限和最低定量限分別為1ng/ml和2.5ng/ml。該方法成功用于美托拉宗在人血漿中的藥代動力學(xué)研究，靈敏性、重現(xiàn)性好。

美托拉宗;生物利用度;藥代動力學(xué)

美托拉宗是喹唑啉類藥物，化學(xué)名是7-氯-1,2,3,4-四氫-2-甲基-3-(2-甲基苯基)-4-氧代-6-喹唑磺酰胺，美托拉宗是喹唑啉類利尿劑，與通常的噻嗪類利尿劑功效相當。美托拉宗的作用機制是干擾腎小管對電解質(zhì)的重吸收。美托拉宗主要在皮質(zhì)稀釋部位抑制鈉的重吸收，對近曲小管作用弱。鈉和氯離子被排出的總量大致相等。腎小管遠端鈉子交換量的增加導(dǎo)致鉀離子排泄的增加。美托拉宗不抑制碳酸酐酶。美托拉宗對人類的藥理作用與其他動物相似，表現(xiàn)為增加磷酸鹽和鎂離子的排泄，顯著增加腎小球濾過率功能嚴重受損的患者的鈉離子的排泄。這個作用機制已經(jīng)在動物體內(nèi)通過微刺控研究被證明。

美托拉宗的抗高血壓機制尚不明了，可能與其利尿、促排尿作用相關(guān)。美托拉宗的藥代學(xué)的分析方法僅有少數(shù)報道，包括HPLC法和LC-MS法。我們的目的是尋找一個新的靈敏的美托拉宗藥代學(xué)的分析方法。

1 試劑與材料

1.1 藥品 美托拉宗標準品含量為99.86%，廠家是江蘇倍達醫(yī)藥科技有限公司。塞來昔布標準品含量為99.38%，廠家是南京中標晨曦化學(xué)技術(shù)有限公司，乙腈（色譜級）、磷酸二氫鉀、磷酸、甲醇、三氯乙酸（均為分析純）均采購自美國天地公司。整個實驗過程中均使用超純水設(shè)備制備的水。在這個實驗中使用的新鮮冷凍血漿來自山東省血液中心，并且使用前一直貯存在（-70±2）℃的溫度條件下。

1.2 使用儀器 高效液相系統(tǒng)由以下儀器組成：10AT-VP高效液相色譜儀（Shimadzu Ltd.,Japan）；帶100μl定量環(huán)手動進樣器和紫外分光檢測器（Shimadzu Ltd.,Japan），檢測波長為225nm，檢測器輸出量化使用CLASS VP(6.01版)色譜分析軟件。分離是使用的LichroCART Purospher○RC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)，使用0.5%三乙胺混合液（PH3.5）和乙腈（65∶35，v/v）作為流動相，流速為1ml/min，總分析時間為15min，所有分析均在室溫下進行。

1.3 標準液的制備和質(zhì)量控制標準 美托拉宗和塞來昔布(I.S) (1mg/ml)置于乙腈水溶液（1∶1v/v），進一步稀釋得到一系列標準液。通過在空白血漿里加入適當數(shù)量的美托拉宗制成美托拉宗標準液(2.5,5.0,10.0,25.0,50.0,75.0,100.0,250.0 and 500.0ng/ml)。低、中、高質(zhì)控標準液的濃度分別為：6.0、50.0、500.0ng/ml，在使用前這些標準液均貯存于（-20±2）℃溫度下。

1.4 用SPE制備樣品 向0.5ml含有美托拉宗（標準品）血漿樣品中加入0.5ml內(nèi)標物（1.0μg/ml），混合離心。使用菲羅門公司的Strata C18-E色譜柱，順序應(yīng)用乙腈和水潤濕活化小柱。活化好的小柱加入1ml樣品，用水沖洗，使用1ml流動相洗脫藥品和內(nèi)標物，在保留時間內(nèi)血漿樣品內(nèi)的藥物沒有受到內(nèi)源物的干擾（見圖1）。我們也通過別的方法比如：蛋白質(zhì)沉淀法、液-液萃取法等，在這些方法中，還是SPE法結(jié)果更精確（98.28%重現(xiàn)率）。

圖1 空白樣品色譜圖

2 結(jié)果

2.1 選擇性/敏感性 方法的選擇性考察是通過篩選6批不同的空白人血漿樣品完成的。在這個條件下，美托拉宗和內(nèi)標物的保留時間分別為7.97min和10.36min。其它雜峰來源于血漿內(nèi)其它成分。美托拉宗和內(nèi)標物在上述色譜條件下溶解度很好，在保留時間內(nèi)沒有受到其他內(nèi)源物的干擾（見圖2）。

圖2 樣品色譜圖

2.2 精確度與精密度 本方法的精確度平均百分比為98.37%，在保留時間內(nèi)，分別在6.0，50.0和500.0ng/ml的條件下，日內(nèi)精密度分別為（5.82±0.43）ng/ml，（49.85±1.48）ng/ml，（491.35±13.16）ng/ml（見表1）。

表1 美托拉宗的精確度與精密度

2.3 線性 線性關(guān)系研究使用7個濃度的美托拉宗樣品(2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0、100.0、250.0、500ng/ml)。在濃度范圍內(nèi)峰面積符合線性關(guān)系。在所有濃度點每個試驗都要在3個不同的日期重復(fù)3次獲得數(shù)據(jù)。相關(guān)系數(shù)‘r2’為0.9978(見表 2、圖 3 和圖 4)。

2.4 回收率 美托拉宗在6.0,50.0and 500.0ng/ml濃度下，回收率分別為98.87%，99.03%和99.94%。

2.5 穩(wěn)定性研究 原液貯存在4℃條件下，進行短期和長期穩(wěn)定性研究，所得數(shù)據(jù)均無明顯偏離。美托拉宗在血漿中的穩(wěn)定性研究通過測定隨時間推移質(zhì)控樣品中的藥物濃度變化來進行。質(zhì)控樣品經(jīng)過三個凍融循環(huán)并與新鮮配制的樣品進行比較以確定其穩(wěn)定性。在這種貯存條件下，質(zhì)控樣品中美托拉宗的平均濃度沒有發(fā)生變化。根據(jù)長效穩(wěn)定性試驗推斷，在人血漿中的美托拉宗在（-20±2）℃條件下至少可以穩(wěn)定的貯存30d（見表3）。

表2 美托拉宗矯正曲線

圖3 美托拉宗矯正曲線

表3 美托拉宗穩(wěn)定性試驗研究報告

圖4 平均血藥濃度

2.6 藥代動力學(xué)研究 對Cmax,Tmax,半衰期,消除速率常數(shù)K,AUC0-t，AUC0-∞這些藥代動力學(xué)參數(shù)進行了計算。參比制劑和受試制劑相比較(見表4)。

表4 美托拉宗藥代動力學(xué)參數(shù)對照

3 結(jié)論

固相萃取人血漿中的美托拉宗比其他萃取法更精確。這個方法具有很高的精確度、精密度、重吸收度而且分析時間較短。必將成為美托拉宗在人體內(nèi)藥代動力學(xué)研究的有用的工具。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2014.3.105

山東 250100 山東省濟南市歷下區(qū)第三人民醫(yī)院藥劑科（孫卉玲）