王小巧　 朱芮　 李瓊潔等

摘要 [目的]探索預(yù)處理和培養(yǎng)基類型對(duì)小孢子離體培養(yǎng)的影響。[方法]以洋桔梗為材料進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，研究預(yù)處理和培養(yǎng)基類型對(duì)小孢子離體培養(yǎng)的影響，并篩選胚性愈傷組織適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基、不定芽植株培養(yǎng)基以及最佳生根培養(yǎng)基。[結(jié)果]利用4 ℃低溫預(yù)處理 24 h 有利于小孢子愈傷組織的形成。愈傷組織適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+3 mg/L KT+ 2.5 mg/L 2，4-D；不定芽植株培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA；最佳生根培養(yǎng)基為：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA +1.5 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭。經(jīng)過(guò)染色體倍性鑒定，顯示小孢子培養(yǎng)后染色體數(shù)目減半。[結(jié)論]該方法研究了預(yù)處理和培養(yǎng)基類型對(duì)小孢子離體培養(yǎng)的影響，為洋桔梗游離小孢子培養(yǎng)體系的建立以及單倍體育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 洋桔梗（Eustoma grandiflorum）；小孢子；離體培養(yǎng)；愈傷組織

中圖分類號(hào) S682.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02291-04

Preliminary Study on Microspore Culture of Eustoma grandiflorum

WANG Xiaoqiao， HE Fengmei et al （College of Horticulture and Landscape， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract [Objective] To explore effects of pretreatment and culture medium types on microspore in vitro culture. [Method] With Eustoma grandiflorum as material， effects of pretreatment and culture medium types on microspore culture were studied. The appropriate induction culture medium， adventitious bud plant culture medium and optimum rooting culture medium for callus were obtained. [Result] The result showed that treating microspore 4℃ for 24 hours benefited the growing of callus. Solidliquid medium containing MS+3mg/L KT+2.5 mg/L 2.4D was conducive to callus induction， medium containing MS+1 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L Sucrose+6.1 g/L Agar was beneficial to adventitious buds induction， suitable medium for root growth contained MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.5mg/L IBA+30 g/L Sucrose +6.1 g/L Agar+0.3 g/L Active carbon. Result of the chromosome ploidy identification showed that the chromosome numbers were halved through microspore culture. [Conclusion] The effects of pretreatment and culture

medium types on microspore in vitro culture were studied， which will lay a foundation for establishment of Eustoma grandiflorum microspore culture system and haploid breeding.

Key words Eustoma grandiflorum； Microspore； Culture in vitro； Callus

洋桔梗（Eustoma grandiflorum）又名草原龍膽，為龍膽科草原龍膽屬（Eustoma）植物，瓶插期長(zhǎng)、耐長(zhǎng)途運(yùn)輸，花姿雅麗，花形別致，花色豐富，具有較高的觀賞價(jià)值，是世界上十分流行的高檔切花之一[1]。我國(guó)各地也競(jìng)相引種栽培，極具市場(chǎng)開發(fā)前景。但其種源主要是從國(guó)外進(jìn)口F1代雜種，價(jià)格昂貴[2]。洋桔梗是異花授粉植物，容易授粉，種子量多，自交存在衰退現(xiàn)象，自交系之間雜交（F1）表現(xiàn)出超強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)。由于國(guó)外引進(jìn)洋桔梗品種復(fù)雜的遺傳背景，使其F1代雜交種子后代分離嚴(yán)重，不能留種種植，因此，傳統(tǒng)的洋桔?；ɑ苡N常采用雜交一代（F1）育種程序進(jìn)行。在雜種優(yōu)勢(shì)利用中，親本必須是純合的，經(jīng)組配后才能得到性狀一致具有強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)的雜交種。洋桔梗常規(guī)的育種方法選育自交系，獲得一個(gè)純系需要6～8年，時(shí)間期限長(zhǎng)，選擇效率低，耗費(fèi)大量的人力和物力，再加之洋桔梗為異花授粉，存在自交衰退現(xiàn)象，從而導(dǎo)致洋桔梗自交系的獲得較困難[3]。

通常由小孢子培養(yǎng)來(lái)獲得純合材料僅需要1～2年時(shí)間，大大縮短自交系選育年限，加速育種進(jìn)程，提高育種效率，是現(xiàn)代植物育種中快速、高效的育種途徑之一[4-5]。國(guó)內(nèi)外已有利用小孢子培養(yǎng)獲得植物自交系的報(bào)導(dǎo)[6-8]，但關(guān)于洋桔梗小孢子培養(yǎng)獲得單倍體自交系的研究鮮有報(bào)道。筆者開展洋桔梗小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究，以期為解決我國(guó)洋桔梗雜交種子生產(chǎn)問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。供試洋桔梗材料，來(lái)自玉溪市通海縣瑞園園藝有限公司，經(jīng)鑒定為龍膽科草原龍膽屬（Eustoma）植物洋桔梗（Eustoma grandiflorum）。

1.1.2 主要試劑。所用試劑均為遇分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 小孢子的分離純化。采集田間健壯植株上的花蕾，在4 ℃的冰箱中放置1～2 d，進(jìn)行抗寒鍛煉。取出后用洗滌液清洗外表面并用流動(dòng)水沖洗 5 min，在超凈工作臺(tái)上用濃度75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡 10～15 min，無(wú)菌水洗滌3次，每次5 min。瀝干水分后，在B5培養(yǎng)基中用玻璃棒碾壓花蕾，擠出小孢子。小孢子懸浮液經(jīng)孔徑300目的尼龍網(wǎng)1 000 r/min下離心3次，時(shí)間分別為15、10和5 min，棄上清液，加入MS培養(yǎng)液混合，用移液器取3.0 ml混合液于MS固體培養(yǎng)基中，25 ℃下暗培養(yǎng)1周，轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)芽分化的培養(yǎng)。將在光照下培養(yǎng)長(zhǎng)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接至含有不同濃度6BA和NAA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行固體培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽分化。溫度25 ℃，光照2 000 lx，pH值5.8～6.0。

1.2.3 生根培養(yǎng)。將上述長(zhǎng)出的小苗，轉(zhuǎn)入含有6BA、NAA和IBA的MS生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。采用5組處理，處理1：MS+0.2 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L活性炭；處理2：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭；處理3：MS+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭；處理4：MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭；處理5：MS+0.5 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭，2周后進(jìn)行生根統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 小孢子再生植株倍性鑒定。取田間生長(zhǎng)的“ceremony orange”植株和小孢子再生植株根尖1.0～1.5 cm放入0.002 mol/L的8羥基喹啉中固定24 h，用無(wú)菌水沖洗3次，放入卡諾氏溶液中（無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1，V/V）2 h，無(wú)菌水沖洗干凈后，在1 mol/L的HCl中浸泡5～10 min，無(wú)菌水沖洗3次，制片，卡寶品紅染色，顯微鏡下檢測(cè)染色體數(shù)目變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)小孢子胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.1.1 花蕾大小對(duì)小孢子胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。小孢子的發(fā)育時(shí)期是影響小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一，選擇合適的花粉發(fā)育時(shí)期可極大地提高植株小孢子胚性愈傷組織發(fā)生的誘導(dǎo)頻率。圖1表明，隨著花蕾的長(zhǎng)度的增加，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率增加，當(dāng)花蕾大小在2.0～2.5 cm時(shí)，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最大；當(dāng)花蕾長(zhǎng)度超過(guò)3 cm時(shí)，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率降低。因此，當(dāng)花蕾大小2.1～2.5 cm時(shí)，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高，達(dá)到76%。對(duì)花蕾的小孢子進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)此時(shí)期正是小孢子單核靠邊期。

圖1 花蕾大小對(duì)小孢子胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.1.2 低溫預(yù)處理對(duì)小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。低溫預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)的一個(gè)關(guān)鍵，適宜的低溫和處理時(shí)間可改善小孢子代謝活動(dòng)，有利于小孢子適應(yīng)離體后的培養(yǎng)環(huán)境，促使小孢子正常生長(zhǎng)。圖3表明，不同的低溫處理對(duì)小孢子愈傷組織誘導(dǎo)有一定作用，當(dāng)溫度處于4 ℃，愈傷組織誘導(dǎo)率最高。隨著處理時(shí)間的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率增加，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最大，隨著時(shí)間的再增加，誘導(dǎo)率降低。因此，最佳的預(yù)處理時(shí)間和溫度分別為24 h和4 ℃。

圖2 低溫預(yù)處理對(duì)小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.1.3 不同水平的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑激素對(duì)小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。培養(yǎng)基成分對(duì)小孢子胚的誘導(dǎo)和形成影響極大，其中蔗糖濃度、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及添加有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分至關(guān)重要。每個(gè)配方重復(fù)5次。由表1和圖3可知，培養(yǎng)20 d后，MS+3.0 mg/L KT+2.5 mg/L 2.4D誘導(dǎo)的胚性愈傷組織最多，其誘導(dǎo)率達(dá)75%。MS+2.0 mg/L KT+2.5 mg/L 2.4D誘導(dǎo)的胚性愈傷組織最少，其誘導(dǎo)率為28%。

2.2 芽誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)

2.2.1 不同水平的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)誘導(dǎo)芽的影響。采用不同水平的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)愈傷組織出芽，每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種4個(gè)胚性愈傷組織，共20個(gè)愈傷組織。由表2可知，MS+1.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA誘導(dǎo)芽的效率最好，達(dá)到85%。MS+2.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA和MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA均未出苗。

圖4 愈傷組織誘導(dǎo)芽分化

2.2.2 不同水平的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植株生根的影響。采用5個(gè)不同處理，觀察不同水平的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)生根的影響。結(jié)果表明：不添加IBA或者6BA生根率都很低；當(dāng)6BA的濃度超過(guò)0.2 mg/L IBA或濃度低于1.5 mg/L植株的生根率都不佳。因此，6BA濃度過(guò)高、IBA濃度過(guò)低都影響洋桔梗生根率。選擇合適的濃度是植株生根的關(guān)鍵。誘導(dǎo)植株生根的最佳配方為：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭生根率最佳，可達(dá)到80%以上。

2.3 染色體數(shù)目的比較 對(duì)小孢子培育植株及田間四倍體植株進(jìn)行染色體數(shù)目檢測(cè)[9]，共檢測(cè)10棵植株，30條根，觀察60個(gè)細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)小孢子培育植株根尖染色體數(shù)均為36條，田間四倍體植株根尖染色體數(shù)為72條。由此說(shuō)明，試驗(yàn)進(jìn)行的小孢子組織培養(yǎng)苗是二倍體。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)花藥和小孢子離體培養(yǎng)技術(shù)開展植物單倍體育種工作是現(xiàn)代生物技術(shù)育種最有效的手段之一，但在植物花藥組織培養(yǎng)中，很多情況下獲得的再生植株中并沒(méi)有單倍體植株的存在，花藥培養(yǎng)獲得的再生植株絕大部分是來(lái)自于花藥壁的二倍體細(xì)胞，也有可能少量來(lái)自單倍性的花粉粒。因此，單倍體出現(xiàn)的頻率很低，甚至沒(méi)有，因而，不能形成足夠的選擇群體，同時(shí)也導(dǎo)致再生植株混雜（混倍），要從這樣的混雜植株中再挑選出單倍體植株費(fèi)工費(fèi)時(shí)。從培養(yǎng)過(guò)程來(lái)看，花藥離體培養(yǎng)相對(duì)較容易，技術(shù)比較成熟，而小孢子離體培養(yǎng)盡管不受花藥壁、藥隔等二倍體細(xì)胞的干擾，但這種特殊單倍體細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)難度較大，目前只在少數(shù)植物上獲得成功[10]。

小孢子培養(yǎng)技術(shù)是一種高效、安全的育種新途徑，能快速地從大量群體中獲得新的種資源。并且有力地縮短了雜交育種的年限。另一方面該技術(shù)的應(yīng)用可以為植物的新種質(zhì)的創(chuàng)建和新品種的快速選育提供新的思路、途徑和方法[11]。

花蕾中小孢子發(fā)育的一致性對(duì)胚狀體或愈傷組織的再生有很大影響。不同品種單核靠邊期的花蕾發(fā)育時(shí)期是不一樣的，同一品種生長(zhǎng)環(huán)境不一致，其單核靠邊期的花蕾發(fā)育時(shí)期也不一致。試驗(yàn)通過(guò)萊卡顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，采集的洋桔?！癱eremony orange”花蕾在2.0～2.5 cm時(shí)處在單核靠邊期，處在該時(shí)期的花蕾胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)到76%；再生植株誘導(dǎo)率100%。與其他小孢子培養(yǎng)不同的是胚性愈傷組織誘導(dǎo)并非采用NLN13液體培養(yǎng)基，而是采用MS固液培養(yǎng)，一方面胚性愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)液體培養(yǎng)提高很多，另一方面可以大大降低污染率。組織培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織易出現(xiàn)褐化以及活力不足，但在培養(yǎng)基中加入0.1 g/L的活性炭并且及時(shí)的更換新鮮培養(yǎng)基可以有效的減輕褐化現(xiàn)象。對(duì)于再生植株根尖染色體的鑒定，根尖在9點(diǎn)前取要比在其他時(shí)間取得根尖效果好，能夠較清楚的看清染色體的條數(shù)。隨著小孢子培養(yǎng)條件的不斷改善 和培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)。小孢子培養(yǎng)技術(shù)和單倍體育種手段將在草原龍膽屬作物的育種領(lǐng)域中發(fā)揮出更大的作用。

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