梁素鈺　李琳　杜倩等

摘要 [目的]研究橡膠草種植前后土壤微生物細(xì)菌的多樣性。[方法]對大田種植橡膠草前后的土壤理化性質(zhì)進(jìn)行考察，并通過454測序技術(shù)對土壤微生物細(xì)菌多樣的數(shù)據(jù)序列進(jìn)行高級分析。[結(jié)果]橡膠草種植后土壤的全氮和全磷略高于種植前，有機(jī)質(zhì)稍有下降。土壤細(xì)菌的OTU數(shù)在橡膠草種植前后相差不大。群落結(jié)構(gòu)分析表明，橡膠草種植前后的細(xì)菌組成大致相同，但各物種所占比例有差異，大多數(shù)的細(xì)菌是不可培養(yǎng)的，其中與氮有關(guān)的菌屬柱狀區(qū)所占比例最大。PCA主成分分析表明橡膠草種植前后土壤微生物群落在細(xì)菌水平上相近，這個結(jié)果與群落分布柱狀圖相吻合。RDA分析表明，土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、土壤含水率、土壤全氮和全磷與細(xì)菌呈正相關(guān)，土壤容重與細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)。[結(jié)論]試驗(yàn)測序數(shù)據(jù)表明，橡膠草種植前后的土壤微生物細(xì)菌在OUT水平上多樣性豐富，在屬的水平上群落結(jié)構(gòu)組成相近，種植橡膠草后土壤理化性質(zhì)發(fā)生了改變。

關(guān)鍵詞 橡膠草（Taraxacum koksaghyz Rodin）；454測序；細(xì)菌；多樣性；土壤微生物

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）08-02264-03

Research of Soil Microbial Bacteria Diversity before and after Planting Taraxacum koksaghyz （Ⅱ）—Advanced Analysis

LIANG Suyu et al

（Key Lab of Sustainable Management of Forest and Environmental Microbiology， Heilongjiang Institute of Forest Engineering and Environment， Harbin， Heilongjiang 150081）

Abstract [Objective] To study soil microbial diversity before and after planting Taraxacum koksaghyz. [Method] Soil physical and chemical characters before and after planting Taraxacum koksaghyz were investigated， 454 sequence technology was used to conduct advanced analysis of soil microbial diversity data sequence. [Result] The results showed that the soil total nitrogen and phosphorus in Taraxacum koksaghyz field were slightly higher than comparison field， while the organic matter was decline slightly. The OTU numbers of bacteria was almost same in both Taraxacum koksaghyz field and comparison field. Community composition analysis shows that in the case of Genuss level of community distribution histogram， the bacteria in both fields were similar， just a slightly difference in the proportion of each species. The majority of bacteria are nonculturable， in which the nitrogenrelated species with the largest proportion of columnar zone occupied most. PCA principal component analysis showed that the community composition of bacteria in both fields were similar， this result is consistent with the community distribution histogram. RDA analysis showed that soil pH， organic matter， soil moisture， soil total nitrogen and total phosphorus are associated with bacteria positively， soil bulk density was negatively correlated with bacteria. [Conclusion] The test sequence data indicated that there is an OUT abundance diversity in bacteria and the similar bacterial community structure in Genus level.The soil propeties changed after planting Taraxacum koksaghyz Rodin.

Key words Taraxacum koksaghyz； 454 sequence； Bacteria； Diversity； Soil microbe

橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）為菊科（Compositae）蒲公英屬（Taraxacum）多年生宿根草本植物，喜冷涼氣候，根部所含的膠質(zhì)能制橡膠。新疆、甘肅、陜西以及東北﹑華北﹑西北等地有栽培。研究者對橡膠草體內(nèi)橡膠的形成及品質(zhì)變化、體內(nèi)碳水化合物、果聚糖、多酚氧化酶等化學(xué)成分進(jìn)行了研究[1-10]。為解決國內(nèi)天然橡膠供應(yīng)不足問題，中央輕工業(yè)部曾組織調(diào)查團(tuán)前往新疆對發(fā)現(xiàn)的大面積野生橡膠草進(jìn)行全面考查[11-12]。

近年來，隨著橡膠草的利用越來越大[13-17]，人們對橡膠草的研究維度更加多樣化，從田間種植、組織培養(yǎng)，到分子水平的蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)基因等進(jìn)行了一系列的研究[18-30]。試驗(yàn)主要利用454技術(shù)[31-32]對北方田間種植橡膠草前后的土壤注微生物細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，并對所測序列進(jìn)行數(shù)據(jù)高級分析，以期為橡膠草的種質(zhì)栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以5 m×5 m為試驗(yàn)單元，于種植1年橡膠草和未種植橡膠草的地塊，盡量靠近橡膠草根蛇形分別取5個土樣，每個樣品50.0 g，混勻，過40目土壤篩；過篩后的土樣用錫紙包裹，置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室。用KOK表示種植橡膠草后的樣本，用CK表示種植橡膠草前的樣本。

1.2 方法

1.2.1

樣品的指標(biāo)成分分析。土壤物理性質(zhì)包括土壤含水率和容重，采用烘干法，每份樣品各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測定3次。土壤化學(xué)性質(zhì)的測定包括土壤全氮、全磷、pH值和有機(jī)質(zhì)；其中，全氮含量采用半微量凱氏法（GB7113-87），利用全自動凱氏定氮儀進(jìn)行測定；全磷含量采用鉬銻抗比色法，利用紫外分光度計(jì)測定，每份樣品各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測定3次；土壤pH值利用pH儀測定；有機(jī)質(zhì)采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法測定。

1.2.2

樣品OTU分布VENN分析。統(tǒng)計(jì)多個樣品中所共有的OTU（Operational Taxonomic Units，可操作的分類單元）數(shù)目反映環(huán)境樣品的相似性及重疊情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以venn圖表示。分析時(shí)選用相似水平為97%的OTU，此時(shí)OTU的數(shù)目也可以代表菌種的數(shù)目。使用mothur軟件進(jìn)行分析。

1.2.3

群落結(jié)構(gòu)分析。使用mothur軟件，根據(jù)silva庫中的參考序列對OTU進(jìn)行種屬鑒定并進(jìn)行分類。結(jié)果中包含了該樣品中含有何種微生物和這些微生物各自所含有的序列數(shù)即微生物的豐度信息。

1.2.4

PCA（主成分）分析。采用PCA主成分來分析不同樣品OTU組成的差異，通過方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取能夠最大反映方差值的2個特征值，可以用來進(jìn)行以下分析：確定環(huán)境中的樣品是否具有不同的微生物群落；將環(huán)境間的差異以圖的形式表現(xiàn)出來等。

1.2.5

RDA分析。RDA是基于對應(yīng)分析發(fā)展而來的一種排序方法，將對應(yīng)分析與多元回歸分析相結(jié)合，每一步計(jì)算均與環(huán)境因子進(jìn)行回歸，又稱多元直接梯度分析。此分析可以檢測環(huán)境因子、樣品、菌群三者之間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣地信息與理化性質(zhì)

由表1可知，橡膠草種植后土壤的全氮和全磷略高于種植前，有機(jī)質(zhì)稍有下降。

2.2 樣品OTU分布比較——VENN分析結(jié)果

圖1表明，種植橡膠草的土壤細(xì)菌有4 919個OTU，未種植橡膠草對

2.3 群落結(jié)構(gòu)分析

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，將多個樣品的群落結(jié)構(gòu)分析放在一起對比，以觀測其變化情況。試驗(yàn)選取了50個具有代表性的細(xì)菌菌屬進(jìn)行繪圖，結(jié)果表明，不同的顏色代表不同的種群，橡膠草種植前后的土壤細(xì)菌組成在屬的水平大致相同，各物種所占比例有所差異。圖中的信息顯示大多數(shù)的細(xì)菌是不可培養(yǎng)的，其中淡粉色的柱狀區(qū)所占比例最大是與氮有關(guān)的菌屬。

2.4 PCA（主成分）分析

PCA分析可以用來反映不同樣品中微生物群落組成的相似性以及影響微生物多樣性的主要因素。樣品組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。圖3表明，橡膠草種植前后土壤微生物群落在細(xì)菌水平上處于相同象限，所以生物群落組成相近。

2.5 RDA分析

RDA圖是根據(jù)屬水平的物種制作出來的，但這些屬的物種其實(shí)也是OTU，只是將特定的能在屬上分出類別的OTU篩選出來。箭頭是根據(jù)環(huán)境因子與樣品之間的關(guān)系加進(jìn)去的。圖4表明，土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、土壤含水率、土壤全氮和全磷與細(xì)菌呈正相關(guān)，土壤容重與細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)。樣本在圖中的分散度也說明了土壤微生物在屬的水平上有很大差異。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)主要針對樣地的理化性質(zhì)以及獲得樣品序列數(shù)據(jù)的OTU進(jìn)行土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、PCA主成分和RDA的高級分析。序列的OTU選取是在0.03水平，即97%相似性水平下，和基礎(chǔ)分析選取的序列OTU一致。因?yàn)橄扔胹peciessample數(shù)據(jù)進(jìn)行DCA分析，分析結(jié)果中Lengths of gradient 的第1軸的數(shù)值小于3.0，所以試驗(yàn)選取RDA來進(jìn)行分析。土壤的全氮和全磷水平在橡膠草種植后略有上升，但有機(jī)質(zhì)呈下降趨勢。這可能是因?yàn)樵诜N植橡膠草時(shí)，選取的土質(zhì)不是很好的雜草叢生的荒地，當(dāng)土地由多物種并存轉(zhuǎn)化成單一物種生長時(shí)，是否會存在有機(jī)質(zhì)下降，這也是一個值得繼續(xù)深入探討的話題。另外，樣品的選取是在種植橡膠草1年后，若種植年數(shù)增加，土壤的理化性質(zhì)和土壤微生物的相互影響或許表現(xiàn)得更明顯。

試驗(yàn)測序數(shù)據(jù)高級分析得出如下結(jié)論：①橡膠草種植前后土壤微生物細(xì)菌在OUC水平上多樣性豐富；②橡膠草種植前后的土壤微生物細(xì)菌，在屬的水平上群落結(jié)構(gòu)組成相近，變化不大；③種植橡膠草前后土壤理化性質(zhì)發(fā)生了改變。

參考文獻(xiàn)

[1]

А·А·普羅科菲耶夫，柳大綽.植物體內(nèi)橡膠的形成[J].植物生理學(xué)通訊，1955（6）：30-38.

[2] А·А·Дробков，李有則.橡膠草內(nèi)醣對于橡膠形成的意義[J].植物生理學(xué)通訊，1955（6）：50.

[3] S·M·馬希塔科夫，周嘉槐.橡膠草根在其發(fā)育過程中橡膠及樹脂質(zhì)的變化[J].植物生理學(xué)通訊，1955（6）：51.

[4] S·M·馬希塔科夫，周嘉槐.橡膠草在第二年生長期間根內(nèi)橡膠品質(zhì)的變化[J].植物生理學(xué)通訊，1955（6）：52.

[5] М·Б·Нейман，А·А·ПрокоФьеви，П·С·Шантарович，等.碳水化合物是植物用作綜合橡膠的原始產(chǎn)物[J].植物生理學(xué)通訊，1955（6）：43.

[6] KOLESNIKOV P A.Carboxylase in koksaghyz[J] Dokl Akad Nauk SSSR，1952，85（3）：611-614.

[7] MIKHLIN D M，AKHUNBAEVA B O.Fructosans in roots of Taraxacum koksaghyz[J].Biokhimiia，1956，21（2）：186-190.

[8] KOLESNIKOV P A.Chinones and localization phenoloxidase in koksaghyz[J].Dokl Akad Nauk SSSR，1952，85（4）：847-850.

[9] MIKHLIN D M，PSHENOVA K V.Polyphenol compounds in koksaghyz[J].Biokhimiia，1953，18（1）：24-28.

[10] MIKHLIN D M，BRONOVITSKAIA Z S.Dehydrogenases of koksaghyz[J].Dokl Akad Nauk SSSR，1953，89（5）：893-896.

[11] 成言.橡膠草[J].化學(xué)世界，1950（11）：10-12.

[12] 羅士華.橡膠草[J].科學(xué)大眾，1952（5）：121-122.

[13] CORNISH K，MYERS M D，KELLEY S S.Latex quantification in homogenate and purified latex samples from various plant species using near infrared reflectance spectroscopy[J].Industrial Crops and Products，2004，19：283-296.

[14] BURANOV A U，ELMURADOV B J.Extraction and Characterization of Latex and Natural Rubber from RubberBearing Plants[J].J Agric Food Chem，2010，58：734-743.

[15] 王鳳菊.國外生物橡膠資源開發(fā)動態(tài)[J].中國橡膠，2012（13）：4-7.

[16] 孫樹泉，張繼川，張立群，等.生物橡膠的研究進(jìn)展[J].高分子通報(bào)，2013（4）：42-50.

[17] 趙平娟，安鋒，林位夫，等.大力開展巴西橡膠樹替代產(chǎn)膠植物及技術(shù)研發(fā)的建議[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012（34）：124-130.

[18] OLIVER MUNT，MARINA ARIAS，MNICA HERNANDEZ，et al.Fertilizer and Planting Strategies to Increase Biomass and Improve Root Morphology in the Natural Rubber Producer Taraxacum Brevicorniculatum[J].Industrial Crops and Products，2012，36（1）：289-293.

[19] 梁素鈺，王文帆，劉濱凡，等.能源橡膠草的綜合利用研究[J].能源研究與信息，2010，26（4）：219-224.

[20] 羅成華，閆潔，祝建波.橡膠草高頻再生體系的建立[J].北方園藝，2012（7）：115-119.

[21] 林伯煌，魏小弟.橡膠草的組織培養(yǎng)研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程，2009，33（4）：1-3.

[22] 梁素鈺，王述洋.新型能源戰(zhàn)略植物——橡膠草的開發(fā)與利用[M].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，2008.

[23] JILLIAN COLLINSSILVA，AISE TABAN NURAL，AMANDA SKAGGS，et al.Altered levels of the Taraxacum koksaghyz （Russian dandelion） small rubber particle protein，TkSRPP3，result in qualitative and quantitative changes in rubber metabolism[J].Phytochemistry，2012，79：46-56.

[24] 黃榮輝，?，F(xiàn)周，仇鍵，等.橡膠草膠乳蛋白雙向電泳方法的建立[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2013（2）：272-275.

[25] 孫懷娟.橡膠草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及HMGR1的轉(zhuǎn)化研究[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)出版社，2008.

[26] DANIELA WAHLER，CHRISTIAN SCHULZE GRONOVER，CAROLIN RICHTER，et al.Polyphenoloxidase Silencing Affects Latex Coagulationin Taraxacum Species[J].Plant Hysiology，2009，151：334-346.

[27] THOMAS SCHMIDT，MALTE LENDERS，ANDREA HILLEBRAND，et al.Characterization of rubber particles and rubber chain elongation in Taraxacum koksaghyz[J].BMC Iochemistry，2010，11：2-11.

[28] 李若霖.新疆橡膠草種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2012.

[29] 仇鍵，劉實(shí)忠，張志平，等.橡膠草異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因的電子克隆及分析[J].生物信息學(xué)，2013（3）：209-215.

[30] 王啟超，劉實(shí)忠，校現(xiàn)周.橡膠草HMGR基因的克隆及表達(dá)分析[J].植物研究，2012（1）：61-68.

[31] YARWOOD S，BREWER E，YARWOOD R，et al.Soil microbe active community composition and capability of responding to litter addition after 12 years of no inputs[J].Appl Environ Microbiol，2013，79（4）：1385-1392.

[32] KOOPMAN M M，F(xiàn)USELIER D M，HIRD S，et al.The carnivorous pale pitcher plant harbors diverse，distinct，and timedependent bacterial communities[J].Appl Environ Microbiol，2010，76（6）：1851-1860.