李子夏，賀茂勇，彭 彬

（1.西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，陜西 西安 710021；2.中國科學(xué)院地球環(huán)境研究所黃土與第四紀(jì)國家重點實驗室，陜西 西安 710075；3.武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓科，湖北 武漢 430079）

微量元素雖然在人體內(nèi)的含量不多，但與人的生存和健康息息相關(guān)，對人的生命起著至關(guān)重要的作用。微量元素攝入過量、不足、不平衡都會不同程度地引起人體生理的異常甚至引發(fā)疾病。牙齒作為人體一個重要器官，對微量元素具有富集作用，是揭示疾病和中毒現(xiàn)象的指示器官。因此，牙齒中微量元素對人類健康的作用已引起醫(yī)學(xué)界和生物學(xué)界的重視。近年來，國內(nèi)外學(xué)者針對齲病和微量元素的關(guān)系做過大量研究，認(rèn)為微量元素可能影響齲病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后過程［1－2］。

隨著人們生活水平的提高，食品加工日趨精細(xì)，相伴而產(chǎn)生的齲齒發(fā)病率日見增長，在我國目前已達(dá)到60%～70%，部分地區(qū)高達(dá)90%［3］。因此，研究預(yù)防和治療齲病的措施顯得十分重要。許多流行病學(xué)調(diào)查、動物實驗和模型試驗均證明，微量元素鍶（Sr）對牙齒健康有著極為重要的影響，并且發(fā)現(xiàn)Sr與齲齒呈顯著負(fù)關(guān)聯(lián)［4－7］。同時，由于牙齒能夠很好地保持其生存地的同位素比值特征，且很少受到污染，牙齒87Sr／86Sr比值已成為國際考古學(xué)界用于探索人和動物遷移活動的首選指標(biāo)［8－14］，廣泛運用于科技考古、法醫(yī)鑒定、古生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域［8－14］。

翁希里等［15］研究表明，陜南地區(qū)是陜西省齲病低發(fā)區(qū)域，對該地區(qū)牙齒微量元素的研究有助于齲病病因解析和齲病的預(yù)防。本研究以陜南地區(qū)現(xiàn)代人牙齒為例，對該地區(qū)居民的健康齒和齲齒牙釉質(zhì)進行Sr元素含量和87Sr／86Sr同位素比值測定，同時測定該地區(qū)代表性水源、巖石和土壤的87Sr／86Sr同位素比值。探討影響健康齒和齲齒牙釉質(zhì)Sr元素和Sr同位素變化的因素，從而獲得測量指標(biāo)的臨床意義，為口腔疾病預(yù)防和齲齒治療提供參考數(shù)據(jù)，同時也為Sr同位素示蹤技術(shù)運用于研究古代人群的遷移、食譜結(jié)構(gòu)等方面奠定基礎(chǔ)。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 7700X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀:美國Agilent公司產(chǎn)品；Ethos Touch Control微波消解系統(tǒng):美國 Milestone公司產(chǎn)品；Milli－Q超純水系統(tǒng):美國Millipore公司產(chǎn)品。

IsoProbe－T固體熱電離質(zhì)譜計:英國GV公司產(chǎn)品，該質(zhì)譜計配置了9個法拉弟接收器、1個戴利接收器，4個離子計數(shù)器，以及一個專門做負(fù)離子的ETP，共15個通道，可以測量常規(guī)和微量樣品固體同位素組成。

1.2 主要材料與試劑

骨頭標(biāo)準(zhǔn) （NIST SRM 1400）:由美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所提供；巖石標(biāo)準(zhǔn)（BCR－2）:來自美國地質(zhì)調(diào)查局；Sr同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（NBS987）:來自美國NIST。實驗所用 H2O經(jīng)Milli－Q系統(tǒng)純化，電阻為18.2MΩ·cm；硝酸（HNO3）:優(yōu)級 純；30% 雙 氧 水 （H2O2）；HCl，HNO3:均用DST－1000亞沸蒸餾裝置雙瓶亞沸蒸餾器純化。

所有實驗均在超凈化學(xué)實驗室完成。

1.3 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀工作條件

霧化器:Agilent babinghton型高鹽霧化器；霧化室:石英雙通道，Piltier半導(dǎo)體控溫在（2±0.1）℃；RF功率:1500W；冷卻氣流速:15 L／min；載氣流速:1.26L／min；采樣深度:8.2 mm；樣品提升速度:0.4mL／min；采樣錐孔直徑:1.0mm；截取錐孔直徑:0.4mm；采樣錐、截取錐材料:Ni錐。

1.4 牙齒樣品采集及預(yù)處理

采集久居中國陜西省南部地區(qū)當(dāng)?shù)鼐用耠x體牙。健康牙齒采集要求離體牙標(biāo)本提供者不抽煙、不酗酒，因智齒阻生畸形、正畸治療或其他原因而拔除的健康恒牙，從中挑選牙冠完整，無齲壞，斑釉及釉質(zhì)發(fā)育不全，牙合面無明顯磨損、缺損的離體牙；齲齒挑選有明顯齲洞的牙齒。離體牙根據(jù)標(biāo)本提供者年齡段分為5組，每組選取男、女性各10顆。同時按照地質(zhì)采樣要求，采集該地區(qū)主要的飲用水、代表性巖石和土壤樣品［16－17］。

將收集的牙體標(biāo)本先用 Milli－Q水沖凈表面血跡，放入盛有丙酮溶液的磨口玻璃瓶浸泡24h，再用手術(shù)刀將附著牙表面的軟組織等有機物仔細(xì)刮凈，并用Milli－Q水和乙醇沖洗干凈，烘干，依次編號。采用加熱敲擊法將牙齒的牙釉質(zhì)與牙本質(zhì)分開［18］。收集分開的牙釉質(zhì)，用瑪瑙缽研磨至200目。巖石樣品和土壤樣品同樣用瑪瑙缽研磨至200目。

1.5 樣品消解

1.5.1 牙齒樣品消解 準(zhǔn)確稱取0.05g研磨后牙釉質(zhì)樣品于微波消解罐中，加入5mL 50%HNO3和2mL 30%H2O2溶液，輕輕晃動消解罐，然后滴入約2mL Milli－Q水，在1000W功率下進行微波消解。微波消解升溫程序為:5 min內(nèi)由室溫升溫至120℃，保持3min，然后在8min內(nèi)繼續(xù)升溫至220℃，保持15min至消解結(jié)束。試樣消化完全后，自然冷卻；用 Milli－Q水轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容；同步做試劑空白實驗；實驗中用骨頭標(biāo)準(zhǔn)樣品進行質(zhì)量控制。

1.5.2 土壤和巖石消解 準(zhǔn)確稱量0.25g土壤和巖石樣品于微波消解罐中，加入3mL HNO3，1mL HF和1mL H2O2，按照文獻(xiàn)［19］方法進行消解，實驗中用巖石標(biāo)準(zhǔn)BCR－2進行質(zhì)量控制。

1.6 離子交換法分離富集Sr元素

采用賀茂勇等［20］建立的Sr特效樹脂方法分離富集牙齒樣品中的Sr元素，對Sr－Spec樹脂分離富集Sr的回收率進行研究。結(jié)果表明，Sr的回收率在98.9%～101.3%之間，完全達(dá)到定量回收Sr的標(biāo)準(zhǔn)。Sr－Spec特效選擇性樹脂與普通陽離子交換樹脂相比，特效樹脂的使用量和酸淋洗量均明顯減少，分離效率大大提高，可實現(xiàn)Sr與基質(zhì)中Ca和Rb的較徹底分離［21－25］。

具體試驗方法是:取消解完全的牙齒溶液（約含200ng Sr）于石英燒杯中，置于180℃電熱板上，蒸發(fā)濃縮至0.5mL左右（因牙齒樣品富含Ca，溶液蒸干后會生成難溶的鹽類），加入8 mol／L HNO3完全溶解，上Sr特效離子交換柱，遵循少量多次的原則，共用酸3mL；Sr很快吸附在樹脂柱上，再用8mol／L HNO3洗滌，每次2mL，重復(fù)4次，可完成銣（Rb）與其它大量鹽分的分離；最后用0.05mol／L HNO3將Sr洗脫，收集淋洗液，每次2mL，重復(fù)4次，將收集的淋洗液蒸干，準(zhǔn)備點樣，上機測試。

1.7 Sr同位素質(zhì)譜測定

采用IsoProbe－T質(zhì)譜計測定Sr同位素。向蒸干的樣品中加入少量超純水，逐滴涂到鉭帶上，再加入1μg 10%H3PO4（超純），蒸干后增大電流，趕走過量H3PO4，并加熱至暗紅，約2～3s，裝入質(zhì)譜計。測樣時儀器的真空度優(yōu)于10－5Pa。

以法拉弟接收器靜態(tài)測量Sr同位素組成，以戴利接收器監(jiān)測Rb對Sr的同質(zhì)異素干擾。由于Rb相對Sr電離溫度低，且Sr－Spec樹脂可以近乎完全分離Rb和Sr，點樣所用試劑帶來的微量Rb可在Sr正常發(fā)射溫度下消耗殆盡，在85Rb／86Sr小于3×10－5時，測量Rb對Sr的干擾可以忽略。測量時，采用指數(shù)率對Sr同位素比值進行質(zhì)量分餾校正（校正參數(shù)86Sr／88Sr＝0.1194）。數(shù)據(jù)采集的積分時間為每個樣品掃描6s，每次測量為100組掃描，這樣獲得的87Sr／86Sr比值測量精度優(yōu)于0.002%。

2 結(jié)果與討論

2.1 巖石和土壤樣品微波消解質(zhì)量控制

為了驗證微波消解測定土壤和巖石方法的有效性，采用巖石標(biāo)準(zhǔn)BCR－2進行質(zhì)量控制，結(jié)果列于表1?？梢钥闯?，所有測定元素均與標(biāo)準(zhǔn)推薦值接近，說明消解方法可靠、有效。

表1 微波消解ICP－MS測定巖石標(biāo)準(zhǔn)BCR－2（n＝4）Table 1 The results of BCR－2using microwave digestion and ICP－MS（n＝4）

2.2 健康齒和齲齒牙釉質(zhì)Sr含量

采用ICP－MS對采集離體牙牙釉質(zhì)的Sr含量進行測定，結(jié)果示于圖1。

圖1表明，雖然牙齒樣品采集于不同性別、不同年齡段的標(biāo)本提供者，但是，齲齒牙釉質(zhì)中的Sr含量顯著低于健康牙釉質(zhì)。健康牙齒Sr含量在128.00～156.77μg／g之間，而齲齒Sr含量在79.70～85.80μg／g之間。實驗結(jié)果說明，Sr是人體健康與否的一種指示元素，Sr含量與牙齒是否患齲有著顯著相關(guān)性，這與文獻(xiàn)［26－27］的研究結(jié)果一致。Curzon等［4－5］研究了高齲區(qū)和低齲區(qū)居民牙釉質(zhì)中Sr含量，結(jié)果表明，高齲區(qū)牙釉質(zhì)中Sr含量明顯低于低齲區(qū)。

圖1 牙齒樣品中Sr含量（n＝10）Fig.1 The results of Sr concentration in samples of teeth

牙釉質(zhì)中超過96%的部分為無機物，主要由鈣磷酸羥基磷灰石組成。Sr的化學(xué)性質(zhì)和原子半徑與Ca相似，在牙齒形成過程中，Sr可以取代羥基磷灰石晶格中的Ca離子，成年個體牙釉質(zhì)中的Sr濃度通?？蛇_(dá)50～400μg／g。Sr抗齲的作用機制可能是:1）改變羥基磷灰石結(jié)晶的大小，結(jié)晶變大可使表面減小而不易溶解；2）在羥基磷灰石晶體表面形成一穩(wěn)態(tài)表面包層，從而降低釉質(zhì)的溶解度或酸溶速度。根據(jù)溶液介質(zhì)的不同，可能存在下列含鍶磷灰石鉻合物:（Ca）6（Sr）4（PO3）6（OH）2，（Ca）6（Sr）4（PO3）6（F）2；3）抑制細(xì)菌生長，減少產(chǎn)酸，或致齲細(xì)菌與表面釉結(jié)合，抑制由糖引起的pH下降等。

2.3 健康齒和齲齒牙釉質(zhì)87Sr／86Sr測定結(jié)果

根據(jù)上述步驟，對在陜西省南部地區(qū)采集的離體牙樣品的牙釉質(zhì)、水體和巖石樣品進行化學(xué)分離及Sr同位素測定。該地區(qū)代表性水源、代表性巖石、土壤的87Sr／86Sr值分布示于圖2，其87Sr／86Sr值分別在0.710497～0.710991，0.707715～0.0.711484，0.706742～0.711883之間。該地區(qū)健康齒樣品的牙釉質(zhì)中87Sr／86Sr在0.710948～0.711037之間，齲齒樣品的牙釉質(zhì)中87Sr／86Sr在0.710935～0.711034之間，示于圖3。

圖2 當(dāng)?shù)卮硇运础r石和土壤的87Sr／86Sr比值Fig.2 The results of 87Sr／86Sr in water，rocks and soils

圖3顯示，健康齒和齲齒牙釉質(zhì)87Sr／86Sr比值在0.710935～0.711037之間變化，且變化區(qū)間在自然水體、巖石和土壤的87Sr／86Sr范圍內(nèi)，該比值基本趨于穩(wěn)定，并且在年齡和性別因素中沒有顯著差異。

研究表明，生活環(huán)境中微量元素的豐缺將造成人體微量元素攝入的多少及平衡與否，這是因為人體中的微量元素主要來自飲水、食物及生活環(huán)境，環(huán)境元素分布的不平衡是人類患地方病的根本原因。

圖3 牙齒樣品中87Sr／86Sr（n＝10）Fig.3 The results of 87Sr／86Sr in teeth samples

李子夏等［20］認(rèn)為Sr的原子質(zhì)量比較大，同位素間的相對質(zhì)量差很小，當(dāng)Sr同位素從風(fēng)化的巖石進入食物鏈到保存在人體骨骼系統(tǒng)時，87Sr和86Sr的分餾非常小，可以忽略不計，即87Sr／86Sr比值基本保持不變，因此生活在不同地區(qū)的人們，其體內(nèi)的Sr同位素比值可以反映該生活地區(qū)的Sr同位素特征。本研究中，健康齒和齲齒牙釉質(zhì)87Sr／86Sr比值和當(dāng)?shù)卮硇运础r石和土壤87Sr／86Sr比值相一致的結(jié)果也印證了上述觀點。

3 結(jié)論

利用ICP－MS、Sr－Spec樹脂以及正熱電離質(zhì)譜儀實現(xiàn)了對陜南地區(qū)健康齒和齲齒牙釉質(zhì)中Sr同位素的精確測定，試驗結(jié)果表明:

1）陜南地區(qū)不同年齡及性別的齲齒牙釉質(zhì)中Sr含量均顯著低于健康牙釉質(zhì)，證實了Sr含量與齲病有顯著負(fù)關(guān)聯(lián)。

2）生活在同一地質(zhì)背景的陜南居民，其牙釉質(zhì)中Sr同位素比值接近，與是否患齲無明顯相關(guān)性，顯示出Sr同位素的地質(zhì)特異性和穩(wěn)定性。

［1］LANE D W，DUFFY C A.The analysis of trace elements in human teeth collected from the Oxfordshire area in the UK［J］.Nucl Instrum Methods Phys Res B，1996，118（1／2／3／4）:392－395.

［2］MATTHEW J K，JENNIFER M，PAUL O.Trace element concentrations in teeth－a modern Idaho baseline with implications for archeometry，forensics，and palaeontology［J］.J Archaeol Sci，2013，40（4）:1689－1699.

［3］齊小秋.第三次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008.

［4］CURZON M E J.An epidemiologic study of strontium on human dental caries［J］.Biol Trace Element Res，1981，3:309－316.

［5］CURZON M E J.The relation between caries prevalence and strontium concentrations in drinking water，plaque，and surface enamel［J］.J Dent Res，1985，64（12）:1386－1388.

［6］EVA R，DULA A，MARTA K.Determination of some trace elements in human tooth enamel［J］.Fresenius J Anal Chem，2000，367（8）:748－754.

［7］RIYAT M，SHARMA D C.Analysis of 35inorganic elements in teeth in relation to caries formation［J］.Biol Trace Element Res，2009，129（1／2／3）:126－129.

［8］BRNTLEY R A，PRICE T D，STEPHAN E.Determining the‘local’87Sr／86Sr range for archaeological skeletons:A case study from neolithic europe［J］.J Archaeol Sci，2004，31（4）:365－375.

［9］ALVIRA F C，ROZZI F V R，TORCHIA G A，et al.A new method for relative Sr determination in human teeth enamel［J］.J Anthropol Sci，2011，89:1－8.

［10］MATTHEW J K，JENNIFER M，PAUL O.Trace element concentrations in teeth－a modern Idaho baseline with implications for archeometry，forensics，and palaeontology［J］.J Archaeol Sci，2013，40（4）:1689－1699.

［11］KNUDSON K J，PRICE T D.The use of strontium isotope analysis to investigate tiwanaku migration and mortuary ritual in bolivia and peru［J］.Archaeometry，2004，46（1）:5－18.

［12］COPELAND S R，SPONHEIMER M，LEE－THORP J A，et al.Strontium isotope ratios（87Sr／86Sr）of tooth enamel:A comparison of solution and laser ablation multicollector inductively coupled plasma mass spectrometry methods［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2008，22（20）:3187－3194.

［13］COPELAND S R，SPONHEIMER M，LEE－THORP J A，et al.Strontium isotope ratios in fossil teeth from South Africa:Assessing laser ablation MC－ICP－MS analysis and the extent of diagenesis［J］.J Archaeol Sci，2010，37（7）:1437－1446.

［14］KUMAGAI A，F(xiàn)UJITA Y，ENDO S，et al.Concentrations of trace element in human dentin by sex and age［J］.Forensic Sci Int，2012，219（1／2／3）:29－32.

［15］翁希里，王捍國，賈 駿，等.陜西省中小學(xué)生齲病抽樣調(diào)查及其趨勢的分析［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2006，16（11）:646－648.WENG Xili，WANG Hanguo，JIA Jun，et al.Spot check and prevalence analysis of dental caries in the students of primary and middle schools in Shannxi province［J］.Chin J Conserv Dent，2006，16（11）:646－648（in Chinese）.

［16］PARK J W，HU Z H，GAO S，et al.Platinum group element abundances in the upper continental crust revisited－New constraints from analyses of Chinese loess［J］.Geochimica et Cosmochimica Acta，2012，93:63－76.

［17］HARB S，El－KAMEL A E，ABBADY A E，et al.Specific activities of natural rocks and soils at quaternary intraplate volcanism north of Sana’a，Yemen［J］.J Med Phys，2012，37（1）:54－60.

［18］李子夏，賀茂勇，逯 海，等.熱電離質(zhì)譜法測定齲齒牙釉質(zhì)87Sr／86Sr同位素比值［J］.地球?qū)W報，2012，33（6）:893－898.LI Zixia，HE Maoyong，LU Hai，et al.Isotopic measurement of Sr in carious teeth of enamel by thermal ionization mass spectrometry［J］.Acta Geoscientica Sinica，2012，33（6）:893－898（in Chinese）.

［19］陳永欣，黎香榮，韋新紅，等.微波消解－電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定土壤和沉積物中痕量稀土元素［J］.巖礦測試，2011，30（5）:560－565.CHEN Yongxin，LI Xiangrong，WEI Xinhong，et al.Determination of trace rare earth elements in soils and sediments by inductively coupled plasma－mass spectrometry with microwave digestion［J］.Rock and Mineral analysis，2011，30（5）:560－565（in Chinese）.

［20］賀茂勇，逯 海，金章東，等.人牙齒中鍶的特效樹脂分離及其同位素測定［J］.分析化學(xué)，2012，40（7）:1109－1113.HE Maoyong，LU Hai，JIN Zhangdong，et al.Separation and isotopic measurement of Sr in tooth samples using selective specific resins［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2012，40（7）:1109－1113（in Chinese）.

［21］HALVERSON G P，DUDáS F，MALOOF A C，et al.Evolution of the87Sr／86Sr composition of Neoproterozoic seawater［J］.Palaeogeogr Palaeoclimatol Palaeoecol，2007，256（3／4）:103－129.

［22］WEST J B，HURLEY J M，DUDáS F，et al.The stable isotope ratios of marijuana.II.strontium isotopes relate to geographic origin［J］.J Forensic Sci，2009，54（6）:1261－1269.

［23］CHARLIER B L A，GINIBRE C，MORGAN D，et al.Methods for the microsampling and highprecision analysis of strontium and rubidium isotopes at single crystal scale for petrological and geochronological applications［J］.Chem Geol，2006，232（3／4）:114－133.

［24］YANG Y H，WU F Y，LIU Z C，et al.Evaluation of Sr chemical purification technique for natural geological samples using common cation－ex－change and Sr－specific extraction chromatographic resin prior to MC－ICP－MS or TIMS measurement［J］.J Anal Che，2012，27（3）:516－522.

［25］BROWN C J，CHENERY S R N，SMITH B，et al.A sampling and analytical methodology for dental trace element analysis［J］.Analyst，2002，127（2）:319－323.

［26］秦俊法.微量元素鍶與齲齒［J］.廣東微量元素科學(xué)，1994，1（4）:1－5.QIN Junfa.Trace element strontium and caries［J］.Guangdong Trace Elements Science，1994，1（4）:1－5（in Chinese）.

［27］李尉卿，張東輝.人齒中微量元素含量的分析探討［J］.廣東微量元素科學(xué)，2002，9（6）:29－34.LI Weiqing，ZHANG Donghui.Analysis on trace elements in human teeth［J］.Guangdong Trace Elements Science，2002，9（6）:29－34（in Chinese）.