文晶亮，李啟紅，李俊平，劉 丹，李 嶺，楊承槐，李慧姣，夏業(yè)才

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

gE蛋白是皰疹病毒家族中較為重要的糖蛋白之一，由位于US區(qū)的US8基因編碼。據(jù)報道皰疹病毒gE基因是皰疹病毒從視網(wǎng)膜、嗅覺上皮細胞、三叉神經(jīng)節(jié)侵入中樞神經(jīng)組織所必須的毒力基因，對皰疹病毒在體內(nèi)毒力表達、侵襲神經(jīng)核沿著神經(jīng)傳遞起著決定性的作用，另外還能促進病毒在細胞之間擴散［1－4］。 目前對人皰疹病毒、偽狂犬病毒、牛皰疹病毒等皰疹病毒糖蛋白gE基因及其編碼蛋白已有大量研究［5－7］，而對鴨瘟病毒 gE基因及其編碼蛋白尚未有深入的報道。因此，本研究PCR擴增了DEV的gE基因完整開放閱讀框（gE）和去信號肽的gE基因（gE’），分別克隆至真核表達載體pCDNA3.1，轉(zhuǎn)染 vero細胞，并應(yīng)用 RT－PCR 和間接免疫熒光檢測gE、gE’蛋白在vero細胞中的轉(zhuǎn)錄、表達，旨在探討gE蛋白在真核細胞中的表達，為gE蛋白的功能研究、鴨瘟抗體檢測奠定基礎(chǔ)，為深入了解鴨瘟病毒感染的發(fā)病機理提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞 鴨腸炎病毒AV1221株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供；vero細胞，由本實驗室保存；E.coli DH5α感受態(tài)細胞，購于天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 真核表達載體 pCDNA3.1，由本實驗室保存；pMD18－T載體、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、EcoRⅠ、XhoⅠ、MarkerⅣ、T4 DNA 連接酶，均購自大連寶生物工程有限公司；Lipofectamine 2000，購自 Invitrogen 公司；OPTI－MEM?I培養(yǎng)液，購自gibco?公司；FITC標(biāo)記的兔抗雞熒光二抗，購自美國sigma－aldrich公司；DMEM高糖細胞培養(yǎng)液、TBD標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購于賽墨飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。

1.1.3 試劑盒 高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于天根生化科技有限公司。

1.1.4 血清 雞抗DEV陽性血清，由本實驗室制備；TBD標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購于賽墨飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)已發(fā)表的基因組序列，設(shè)計擴增鴨腸炎病毒AV1221株的gE基因完整ORF序列（gE）和去信號肽的gE基因（gE’）引物，由invitrogen公司合成。

針對gE的引物：

P1： 5’ －AAGAATTC ATGATGGTTACTTTTAT－3’，下劃線部分為酶切位點EcoR I；

P2：5’－AACTCGAGTCAGATGCGGAAACTAGA－3’，下劃線部分為酶切位點Xho I；

針對gE’的引物：

P11： 5’－AAGAATTCGACTATCATCAAGTGATT－3’，下劃線部分為酶切位點EcoR I；

P22： 5’－AACTCGAGTCAGATGCGGAAACTAGA－3’，下劃線部分為酶切位點Xho I；

1.2.2 DNA 模板提取 按參考文獻［8］進行。

1.2.3 gE基因的克隆 PCR反應(yīng)體系：病毒DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，上游引物 P11 μL，下游引物 P21 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.125 μL，ddH2O 16.375 μL，總體積 25 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，46.2 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸 1 min 30 s，30 個循環(huán)后，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 去信號肽 gE 基因（gE’）序列的克隆 PCR

反應(yīng)體系：病毒 DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，上游引物P111 μL，下游引物 P221 μL，10 ×Ex Taq buffer 2.5 μL，Ex Taq DNA 聚 合 酶 0.125 μL， ddH2O 16.375 μL，總體積 25 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，47℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min。 反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 gE基因測序及序列分析 PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后，分別連接到pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，獲得重組質(zhì)粒 pMD18T－gE、pMD18T－ gE’。將酶切及PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒pMD18T－gE、pMD18T－gE’送Invitrogen公司測序，并用生物信息學(xué)軟件對測序正確的gE基因進行分析，預(yù)測gE基因編碼蛋白的功能。

1.2.6 真核表達載體的構(gòu)建 gE基因測序正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別雙酶切克隆質(zhì)粒 pMD18－gE、pMD18－gE’和載體 pCDNA3.1?；厥?、純化雙酶切g(shù)E、gE’基因和pCDNA3.1線性質(zhì)粒，并用T4 DNA連接酶使雙酶切g(shù)E、gE’基因分別與 pCDNA3.1線性質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α 感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’，進行酶切及 PCR 鑒定。

1.2.7 重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染vero細胞 在轉(zhuǎn)染前20 h，消化vero細胞，轉(zhuǎn)入6孔細胞板，每孔6×105個細胞，待細胞鋪板密度在75%時進行轉(zhuǎn)染。

Lipofectamine 2000／DNA復(fù)合物的制備：分別將 0.8 μg pCDNA3.1－ gE、pCDNA3.1－ gE’質(zhì)粒分別稀釋于不含血清和抗生素的opti－DMEM中，使混合液的終體積均為 50 μL，室溫孵育 5 min；2 μL Lipofectamine 2000分別稀釋于不含血清和抗生素的opti－DMEM中，使混合液的終體積均為50 μL，輕輕混勻，室溫孵育5 min；將50 μL Lipofectamine 2000稀釋液分別滴加到50 μL質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊混勻；室溫孵育20 min。

轉(zhuǎn)染 vero細胞：分別將 100 μL Lipofectamine 2000／DNA復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖動使其均勻混合，置37℃培養(yǎng)4 h，棄去上清，加入10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24 h后，用1%胎牛血清的M199培養(yǎng)基換液，置37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.8 mRNA檢測 參照試劑盒操作說明，提取轉(zhuǎn)染后的細胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照Invitrogen M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶的說明書操作：模板RNA 5 μL，反轉(zhuǎn)錄引物 1 μL，dNTP（10 mmol／L）1 μL，DEPC 水補加至 12 μL，100℃ 水浴 5 min，馬上冰淬滅 1 min；短暫離心后加入 5×buffer 4 μL，DTT（0.1mol／L）2 μL，RNA 酶抑制劑 1 μL，輕輕混勻后 50℃水浴5 min；加入 M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，50 ℃水浴 50 min；70 ℃水浴15 min，冰淬滅；加入1 μL RNaseH，馬上進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)參照 1.2.3 和 1.2.4。

1.2.9 表達產(chǎn)物的檢測 應(yīng)用間接免疫熒光法檢測表達蛋白，方法如下：取出6孔細胞板，用pH為7.2的PBST溶液漂洗細胞1次，加入0.5 mL預(yù)冷的甲醇溶液，固定15 min；棄去甲醇溶液，室溫放置2～5 min自然晾干；用PBST洗1次；加入100倍稀釋的雞抗DEV陽性血清，37℃孵育1 h，棄去DEV陽性血清，每孔用含0.05%吐溫－20的PBST洗3次后，用PBST液洗2次；加500倍稀釋的兔抗雞熒光抗體，37℃溫箱中避光孵育1 h，每孔用含0.05%吐溫－20的PBST洗3次后，用PBST洗2次，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié) 果

2.1 gE基因的 PCR擴增 分別以 gE基因的P1／P2為引物、gE’基因的 P11／P22為引物，病毒 DNA為模板PCR擴增gE、gE’基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1400 bp的DNA片段，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

圖1 gE和gE’基因的PCR擴增結(jié)果

2.2 gE及gE’基因的克隆及酶切鑒定 回收純化后的gE、gE’PCR產(chǎn)物與pMD18－T連接，分別構(gòu)建克隆質(zhì)粒 pMD18T－gE、pMD18T－gE’，酶切、PCR 結(jié)果說明所克隆序列與目的片段大小相近（圖2、圖 3）。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18T－gE酶切及PCR鑒定結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pMD18T－gE’酶切及PCR鑒定結(jié)果

2.3 gE基因序列分析及編碼蛋白的功能預(yù)測

2.3.1 同源性分析結(jié)果 用NCBI網(wǎng)站的在線程序BLASTN對鴨瘟AV1221株gE基因序列與國內(nèi)分離強毒 CHv 株 （GenBank：EU071044.1）、 國 內(nèi) 疫 苗 株（GenBank：EU082088.2）和德國分離強毒 2085 株（GenBank：JF999965.1）基因序列進行比對，結(jié)果表明：鴨瘟AV1221株gE基因序列與國內(nèi)分離強毒CHv株、國內(nèi)疫苗株同源性均為100%，與德國分離強毒2085株同源性為99%，143位堿基變異（T－C），導(dǎo)致第48位氨基酸由蘇氨酸（T）變成了異亮氨酸（I），此外，412位（G－A）和1351位（C－T）堿基同義突變。

2.3.2 信號肽預(yù)測結(jié)果 用CBS網(wǎng)站的在線程序SignalP4.1對gE氨基酸序列進行信號肽預(yù)測，結(jié)果顯示：gE蛋白序列中預(yù)測到的C值、S值或Y值都大于臨界值，推測gE蛋白第1～22位氨基酸為信號肽（圖4）。

2.3.3 跨膜區(qū)的預(yù)測結(jié)果 本研究利用 TMHMM 2.0預(yù)測鴨瘟AV1221株gE蛋白的跨膜區(qū)，其結(jié)果顯示：gE蛋白在397～419位氨基酸有一個跨膜區(qū)，1～396位氨基酸位于胞膜外（胞外區(qū)），420～490位氨基酸位于胞膜內(nèi)（胞質(zhì)區(qū)）（圖5）。

圖4 gE氨基酸序列推倒肽鏈信號肽預(yù)測結(jié)果

圖5 gE氨基酸序列推倒肽鏈跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果

2.4 真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’經(jīng) EcoRⅠ及 XhoⅠ雙酶切后分別得到約1400 bp和5400 bp的條帶，PCR鑒定結(jié)果也獲得了約1400 bp的條帶，說明成功構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’（圖 6）。

圖6 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1－gE、pcDNA3.1－gE’酶切及PCR鑒定結(jié)果

2.5 PCR 鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果 提取 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’轉(zhuǎn)染后的 vero 細胞總 RNA，并以提取的細胞總RNA為模板，分別以gE基因的P1／P2、gE’基因的 P11／P22為引物進行 RT－PCR 擴增，得到了相應(yīng)大小DNA片段（圖7），而以提取的空載體pCDNA3.1轉(zhuǎn)染的 vero細胞總 RNA為模板RT－PCR擴增后則未見相應(yīng)條帶，從轉(zhuǎn)錄水平上說明gE和gE’基因均在vero細胞獲得表達。

圖7 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’和 pCDNA3.1轉(zhuǎn)染vero細胞RT－PCR結(jié)果

2.6 表達產(chǎn)物的免疫熒光鑒定 轉(zhuǎn)染48h后，經(jīng)用熒光顯微鏡觀察，只有重組質(zhì)粒pCDNA3.1－gE’轉(zhuǎn)染的 vero細胞可見綠色熒光（圖 8 A），而pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1 轉(zhuǎn)染的 vero 細胞中未見明顯熒光（圖8B，C），結(jié)果表明gE’基因在vero細胞中獲得了正確表達，具有免疫原性，能與抗體結(jié)合。

圖8 真核表達載體轉(zhuǎn)染vero細胞后間接免疫熒光檢測結(jié)果

3 討論與小結(jié)

本研究結(jié)果表明，鴨腸炎病毒AV1221株 gE基因完整的開放閱讀框長為1473 bp，共編碼490個氨基酸，其中第1～22位氨基酸為信號肽序列。其基因序列與國內(nèi)分離強毒CHv株［9］、國內(nèi)疫苗株［10］和德國分離強毒 2085 株［11］均具有較高同源性，說明鴨腸炎病毒AV1221株gE比較保守。而軟件TMHMM 2.0預(yù)測表明gE蛋白是典型的囊膜糖蛋白，包括較長的胞外區(qū)（396個氨基酸）、跨膜區(qū)（23個氨基酸）和胞質(zhì)區(qū)（71個氨基酸），這與常華［12］結(jié)果一致。

皰疹病毒gE蛋白表達載體的構(gòu)建及表達是其功能研究的重要方面，Zhu等［13］將VZV gE構(gòu)建在真核表達質(zhì)粒pSVK3上，轉(zhuǎn)染COS－7細胞，用間接免疫熒光方法檢測到VZV gE蛋白在COS－7細胞中表達并定位于COS－7細胞的高爾基體。常華［12］利用間接免疫熒光方法檢測到DEV gE蛋白可在感染鴨胚成纖維細胞的胞漿中表達。在本研究中，含信號肽的表達載體pCDNA3.1－gE在vero細胞內(nèi)完成了轉(zhuǎn)錄過程，但卻未能在vero細胞內(nèi)檢測到熒光，與上述研究結(jié)果并不一致，推測可能與所用毒株、宿主細胞不同以及存在信號肽有關(guān)。因此又構(gòu)建了去信號肽的真核表達載體pCDNA3.1－gE’，轉(zhuǎn)染vero細胞后完成了轉(zhuǎn)錄過程，并進行了表達，證實gE自身所具有的信號肽序列可以有效誘導(dǎo)gE蛋白分泌到細胞外，與軟件TMHMM 2.0預(yù)測結(jié)果一致。實驗表明，在真核表達體系中，信號肽的有無對gE蛋白的表達具有顯著的影響。

本研究通過酶切和PCR方法證實，成功構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒 pCDNA3.1－gE 和 pCDNA3.1－gE’，并在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上檢測了pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’在 vero細胞中的表達，下一步將通過G418抗生素篩選穩(wěn)定表達gE的vero細胞系，為gE蛋白的體外表達、功能研究、鴨瘟抗體檢測試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

［1］Mettenleiter T C.Pathogenesis of neurotropic herpesviruses： role of viral glycoproteins in neuroinvasion and transneuronal spread［J］.Virus Res， 2003， 92（2）： 197－206.

［2］Brideau A D， Enquist L W， Tirabassi R S.The role of virion membrane protein endoeytosis in the herpesvirus life cycle［J］.J ClinVirol， 2000， 17（2）： 69－82.

［3］Tirabassi R S， Enquist L W.Role of envelope protein gE endo eytosis in the pseudorabies virus life cycle［J］.J Virol， 1998， 72（6）： 4571－4579.

［4］Ao J Q，Wang J W，Chen X H，et al.Expression of pseudorabies virus gE epitopes in Pichia pastoris and its utilization in an indirect PRV gE－ELISA［J］.J Virol Methods， 2003， 114（2）：145－150.

［5］Snyder A， Poleieova K， Johnson D C.Herpes simplex virus gE／gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons ［J］.J Virol， 2008， 82（21）： 10613－10624.

［6］Wang F， Tang W， McGraw H M， et al.Herpes simplex virus type 1 glycoprotein e is required for axonal localization of capsid，tegument， and membrane glycoproteins［J］.J Virol， 2005， 79（21）： 13362－13372.

［7］Tomishima M J， Enquist L W.A conserved alpha－h(huán)erpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins［J］.J Cell Biol， 2001， 154（4）：741－752.

［8］楊承槐，李俊平，李啟紅，等.含LacZ表達盒的鴨瘟病毒TK基因缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建［J］.中國獸藥雜志，2013，47（1）：7－9.

［9］Wu Y，Cheng A，Wang M，et al.Complete genomic sequence of Chinese virulent duck enteritis virus［ J］.J Virol， 2012， 86（10）： 5965.

［10］Li Y， Huang B， Ma X， et al.Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus［J］.Virology， 2009， 391（2）：151－161.

［11］Wang J， Hoper D， Beer M， et al.Complete genome sequence of virulent duck enteritis virus（DEV）strain 2085 and comparison with genome sequences of virulent and attenuated DEV strains［J］.Virus Res， 2011， 160（1／2）： 316－325.

［12］常 華.鴨瘟病毒gE基因功能初步研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［13］Zhu Z， Hao Y， Gershon M D，et al.Targeting of glycoprotein Ⅰ（gE）of varicella－zoster virus to the trans－goligi network by an AYRV sequence and an acidic amino－rich patch in the cytosolic domain of the molecule［J］.J Virol， 1996， 70（10）：6563－6575.